Способвыделения фермента тромболитического действия

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (ц 584О34

Союз Советских

Социалистических

Республик

Г т «м Ъ

t (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 04.07.75 (21) 2154021/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 15.12.77. Бюллетень № 46 (45) Дата опубликования описания 29.12.77 (51) М. Кл. С 12D 13/10

С 07G 7/026

Государствеииый комитет

Совета Мииистров СССР (53) УДК 577.15.07 (088.8) па делам изобретс ий и открытий (72) Авторы изобретения

Г. В. Самсонов, С. В. Кольцова, Л. К. Шатаева, Н. Н. Кузнецова, К. М. Рожецкая, И. К. Парадеева и 3. Д. Федорова

Институт высокомолекулярных соединений АН СССР и Ленинградский ордена Трудового Красного Знамени научноисследовательский институт гематологии и переливания крови (71) Заявители (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТА

ТРОМБОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

Изобретение относится к производству ферментных препаратов тромболитического действия, преимущественно урокиназы, с помощью ионитов.

Известен способ выделения урокиназы сорбцией на каолине с последующей элюцией

1%-ным раствором этакридина при рН 4,5, подщелачиванием элюата до рН 6,0 и вторичной сорбцией урокиназы из элюата на карбоксиметилцеллюлозе с последующей элюцией

0,36 М фосфатным бу фером с рН 6,5 (1).

Недостатком этого способа является длительность процессов, трудоемкость проведения стадий сорбции и элюции урокиназы на ионитах в статических условиях, а также низкий выход конечного продукта, связанный с неудачным выбором ионитов.

Известен способ выделения урокиназы путем сорбции на силикагеле из фильтрата, полученного после отделения осадка балластных веществ при подщелачивании мочи до рН 7,5 с последующей элюцией урокиназы

4%-ным водным раствором аммиака, осаждением урокиназы из элюата при рН 1,5, последующим растворением осадка в воде, подщелачиванием раствора NaOH до рН 8,0, отделением выпавшего при этом осадка и диализацией и лиофилизацией фильтрата.

В извеством способе дальнейшую очистку полученного препарата урокиназы проводят путем сорбции в динамических условиях на карбоксильном катионите — амберлите

IRC — 50 в водородно-натриевой форме с последующей десорбцией урокиназы 0,5 М раствором NàCI (2).

Этот известный способ очень трудоемок и многостадийный (15 стадий), при этом конечный продукт окрашен пигментами, содержащимися в исходном сырье, а элюция

10 4%-ным водным раствором аммиака с рН

12,0 ведет к частичной денатурации фермента.

Наиболее близким решением к предлагаемому изобретению по технической сущности и

15 достигаемому результату является известный способ выделения фермента тромболитического действия, включающий очистку исходного раствора от примесей, пропускание раствора через колонку с анионитом ФАФ в хлор—

20 форме для депигментации раствора, пропускания депигментированного раствора через карбоксильный катионит КМТ в водородной форме при рН 6,1, промывку катионита для удаления балластных белков и элюцию фер25 мента фосфатным буфером (3).

Недостаток известного способа заключается в том, что при получении урокиназы он сложен и трудоемок из-за необходимости про30 ведения стадии осаждения белков сульфатом

584034

15 аммония из культуральной жидкости, сушки и последующего растворения осадка.

Получаемый по известному способу тромболитический фермент имеет явно выраженные иммуногенные свойства.

С целью снижения стоимости фермента и упрощения способа при получении урокиназы по предлагаемому способу в качестве исходного раствора используют мочу людей, его очистку от примесей осуществляют путем введения едкой щелочи до рН 7,5 — 8,0, очищенный раствор подкисляют перед пропусканием через колонку с анионитом ФАФ до рН 3,5 — 5,7, а промывку катионита КМТ осуществляют фосфатным буфером 005 — 0,2 М при рН 5,8 — 6,0.

Способ осуществляют следующим образом.

Исходный раствор, в качестве которого используют мочу людей, очищают от примесей путем введения едкой щелочи (КОН или

NaOH) до рН 7,5 — 8,0, после чего очищенный раствор подкисляют раствором соляной кислоты до рН 3,5 — 5,7 и пропускают через колонку, содержащую набухший в воде анионит

ФАФ, в хлор — форме для депигментации раствора. Обесцвеченный раствор с колонки с анионитом ФАФ пропускают через колонку, содержащую набухший в воде карбоксильный катионит КМТ в водородной форме при рН,4 — 6, затем катионит КМТ промывают для удаления балластных белков фосфатным буфером 0,05 —:0,2 М при рН 5,8 — 6,0, после чего проводят элюцию урокиназы при 5 — 10 фосфатным буфером с рН 7.

Пример 1. 10 л исходной мочи подщелачивают 1 — 3 М раствором КОН или NaOH до рН 7,5. Выпавший осадок отделяют, а полученный фильтрат подкисляют до рН 35 1—

3 М раствором НСI и пропускают через колонку 5,5р, 20 см, содержащую около 300 мл набухшего в воде анионита ФАФ в хлор— форме. Обесцвеченный раствор с колонки

ФАФ пропускают для сорбции урокиназы через колонку 4,5)(10 см, содержащую около

200 мл набухшего в воде карбоксильного катионита КМТ в водородной форме. Скорость пропускания раствора через ФАФ и КМТ составляет 100 мл/ч.см . По окончании сорбции смолу КМТ промывают 3 л 0,05 М фосфатного буфера с рН 5,9 со скоростью 50 мл/ч см .

После этого проводят элюцию урокиназы при

5 — 10 С с фосфатным буфером с пН 7,0 со скоростью 20 мл/ч см . Собранный элюат диализуют против дистиллированной воды и лиофилизуют. Выход составляет 300000 ед/л исходной мочи.

П р и мер 2. 10 л исходной мочи подщелачивают 1 — 3 М раствором КОН (или NaOH) до рН 8,0. Выпавший осадок отделяют, а полученный фильтрат подкисляют до рН 4,0

1 — 3 М раствором ICI и пропускают через колонку 5,5)(20cM, содержащую около 300мл набухшего в воде анионита ФАФ в хлор-форме. Обесцвеченный раствор с колонки ФАФ

65 пропускают для сорбцпп урокиназы через колонку 4,5)(10 см, содержащую около 200 мл набухшего в воде карбоксильного катионита

КМТ в водородной форме. Скорость пропускания раствора через ФАФ и КМТ составляет

100 мл/ч см . По окончании сорбции смолу

КМТ промывают 3 л 0,1 М фосфатным буфером с рН 6,0 со скоростью 50 мл/ч см . После этого проводят элюцию урокиназы при 5—

10 С фосфатным буфером с рН 6,7 со скоростью 20 мл/ч см . Собранный элюат диализуют против дистиллированной воды и лиофилизуют. Выход составляет 650000 ед/л исходной мочи.

Пример 3. 10 л исходной мочи подщелачивают 1 — 3 М раствором КОН (или NaOH) до рН 8,0. Выпавший осадок отделяют, а полученный фильтрат подкисляют до рН 4,8

1 — 3 М раствором НСI и пропускают через колонку 5,5+20 см, содержащую около 300 мл набухшего в воде анионита ФАФ в хлор-форме. Обесцвеченный раствор с колонки ФАФ пропускают для сорбции урокиназы через колонку 4,5Р,10 см, содержащую около 200 мл набухшего в воде катионита КМТ в водородной форме. Скорость пропускания раствора через ФАФ и КМТ составляет 100 мл/ч см .

По окончании сорбции смолу КМТ промывают 3 л 0,1 М фосфатным буфером с рН 6C со скоростью 50 мл/ч-см . После этого прово дят элюцию урокиназы при 5 — 10 фосфат ным буфером с рН 7,0 со скоростью 20 мл/ч.

° см . Собранный элюат диализуют против дистиллированной воды и лиофилизуют. Выход составляет 2500000 ед/л исходной мочи.

Пример 4. 10 л исходной мочи подщелачивают 1 — 3 М раствором КОН (или NaOH) до рН 8,5. Выпавший осадок отделяют, а полученный фильтрат подкисляют до рН 5,7

1 — 3 М раствором НСI и пропускают через колонку 5,5)(20 см, содержащую около 300 мл набухшего в воде анионита ФАФ в хлор-форме. Обесцвеченный раствор с колонки ФАФ пропускают для сорбции урокиназы через колонку 4,5+10 см, содержащую около 200 мл набухшего в воде катионита КМТ в водородной форме. Скорость пропускания раствора через ФАФ и КМТ составляет 100 мл/ч см .

По окончании сорбции смолу КМТ промывают 3 л 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,0 со скоростью 50 мл/ч см . После этого проводят элюцию урокиназы при 5 — 10 фосфатным буфером с рН 7,5 со скоростью 20 мл/ч см .

Собранный элюат диализуют против дистиллированной воды и лиофилизуют. Выход составляет 1200000 ед/л исходной мочи.

Предлагаемый способ выделения фермента тромболитического действия технологичен, прост и эффективен при получении урокиназы и позволяет получать полностью очищенный от пигментов исходного раствора препарат с одновременным снижением его стоимости, имеющей удельную активность 35000 ед/мг препарата.

584034

Формула изобретения

Составитель Л. Бражникова

Техред Л. Гладкова

Редактор В. Блохина

Корректор Л. Орлова

Заказ 2702/6 Изд. № 981 Тираж 563

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )К-35, Раугискак наб, д, 4/5

Подписное

Типография, пр. Сапунова, 2

Способ выделения фермента тромболитического действия, включающий очистку исходного раствора от примесей, пропускание раствора через колонку с анионитом ФАФ в хлорформе для депигментации раствора, пропускание депигментированного раствора через карбоксильный катионит КМТ в водородной форме при рН 4 — 6, промывку катионита для удаления балластных белков и элюцию фермента фосфатным буфером, о т л и ч а ю щ и йся тем, что, с целью снижения стоимости фермента и упрощения способа при получении урокиназы, в качестве исходного раствора используют мочу людей, его очистку от примесей осуществляют путем введения едкой щелочи до рН 7,5 — 8,0, очищенный раствор подкпсляют перед пропусканием через колонку с анионитом ФАФ до рН 3,5 — 5,7, а промывку катионита КМТ осуществляют фосфатным буфером 0,05 — 0,2 М при рН 5,8 — 6,0.

Источники информации, прпнять1е во внимание при экспертизе

1. Зубаиров Д. М., Асадуллин M. Т., Зинке10 вич О. Д., Ченбосирова Г. Ш., Тимербаев В. Н, «Выделение и некоторые свойства урокиназы человека». Биохимия, 39, вып. 2, 1974, с. 373.

2. Патент Англии № 802326, кл. 2/3/N, опублик. 1958.

15;,3; Самсонов Г. В., Селезнева А. А., Пономарева P. Б., Шатаева Л. К., Орлиевская О. В., Козлова Т. А. «Ферменты микроорганизмов», Пищепромиздат, М., 1973, с. 205 — 209.