Способ изготовления микоплазменного антигена для иммунологических реакций

 

всесоезндэ

}}ц 588237

ОПИСАН

ИЗОБРЕТЕНИЯ дон}з Советских

Соцнапистинвс}<нх

}"-.аспуолнк (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 03.06.74 (21) 2031271/28-15 с присоединением заявки }}" (51) М. Кл.а С 12К 1/00

А 61К 39/00

Гасударственный комитет (23) Приоритет

Совета Министров ьььр (43) Опубликовано 15.01.78. Б}оллетепь М 2 (45) Дата опубликования описания 0!.02.78 (53) УДК 576.8,097.2 (088.8) по делам изобретений и отнрь}тий (72) Авторы изобретения

Х. 3. Гаффаров и Р. В. Боровик (71) Заявитель Казанский ордена Ленина ветеринарный институт им. Н. Э. Баумана (54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ МИКОПЛАЗМЕННОГО

АНТИГЕНА ДЛЯ ИММУНОЛОГИт1ЕСКИХ PEAVU,ÈЙ

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к получению аптигена, предназначенного для серологической диагностики инфекций животных и человека микоплазменной этиологии.

В настоящее время серологическая диагностика заболеваний человека и животных микоплазменной этиологии построена на показателях РСК. Для этой реакции в качестве антигена используют микоплазмы, выращенные преимущественно в жидкой среде, отмытые, ресуспендированные и сконцентрированные в 10 — 40 раз (1).

Помимо получения корпускулярного нативного концентрированного антигена известен способ приготовления антигена путем разрушения биомассы микоплазм, например, обработкой трипсином, хлороформно-метанольной смесью (2).

Однако получаемый антиген не всегда имеет достаточно высокую активность, титр его как правило не выше 1:60.

Целью изобретения является разработка способа получения микоплазменного антигена, позволяющего максимально извлечь комплементсвязывающий (липопротеидного) и прецинитирующий (полисах аридного) антигены и тем самым повысить активность антигена.

Поставленная цель достигается тем, что разрушение биомассы микоплазм проводят

1%-пь}} раствором Твина-40, который добавляют к биомассе в соотношении 1:10 в присутствии равного объема этилового эфира, смесь встряхивают в течение 10 минут, вы5 держива}от в течение часа при +4 С и удаляют образовавшийся верхний эфирный слой.

Нижпий образовавшийся антигенный слой обрабатывают иммуноадсорбептом в течение 24 часов при 37 С с последующим удалением его

10 центрифугированием при 1000 об/мин в течение 20 мин.

Приготовление микоплазменного антигена состоит в следующем.

Микоплазмы выращивают на жидких пи15 тательных средах, приготовленных на основе триптического перевара бычьего сердца по общепринятой прописи с добавлением сыворотки лошади или на среде из кроличьего мясного бульона с добавлением сыворотки крупного

20 рогатого скота. Выращенную культуру микоплазм концентрируют центрифугированием при 20000 об/мин в течение 45 мин в 200—

400 раз. Полученный осадок ресуспендируют в физиологическом растворе, рассматривают

25 как исходную биомассу для приготовления антигена. Раствор Твина-40 готовится в дистиллированной воде ех tempore из расчета 100 мг на 10 мл воды (1 /о -ный раствор) . Твин-40 является многоато ми ым спиртом — полиокси30 этиленсорбитанмонопальмпнат.

588237

Формула изобретения

Составитель И. Тареева

Тсхред Н. Рыбкина

Корректор JI. Орлова

Редактор Н. Аристова

Заказ 3173 18 Изд. Мю 109 Тираж 563

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, К-35, Раушская наб., д. 4!5

Подписное

Типография, пр. Сапунова, 2

Иммуноадсорбент, с помощью которого удаляли неспецифические компоненты, присутствующие в антигене, готовят по методу Лугаmeas u Ternynok (Jmmynochernistry, б, 53 — 56, 1969). С этой целью предварительно полученную кроличью сыворотку к нормальным компонентам питальной среды, обрабатывают глутаровым альдегидом. Кроликов можно иммунизировать по любой схеме с высокими титрами прецинитирующих антител. Затем сыворотку кроликов, иммунную по отношени1о к нормальным компонентам сред, превращают в иммуноадсорбент с помощью глутарового альдегида. К 4 частям сыворотки добавляют

1 часть 2,5 /о глутарового альдегида и оставляют на 4 часа при комнатной температуре.

Образовавшийся гель тщательно измельчают и отмывают от несвязанных белков 0,2 М фосфатным буфером, имеющим рН 7,6 3 — 4 раза, затем отмывают 0,1 М НС1 — глициновь1м буфером с добавлением 0,2М NaC1, имеющим рН 2,8. И наконец снова повторяют процедуру отмывания 0,2М фосфатным буфером до полного удаления белков в надосадке. Хранят иммуноадсорбент в 0,2М фосфатном буфере с добавлением 0,02% азида Na с целью консервации. Биомасса микоплазм подвергается дезинтеграции смесью Твина-40 и эфира.

К 9 частям биомассы мпкоплазм добавляют

1 часть раствора Твина-40 и смешива1от с равным объемом химически чистого этилового эфира. Обработку проводят при комнатной температуре в течение 10 мип при постоянном встряхивании. По истечении этого времени делительную воронку с обрабатываемой смесью помещают в холодильник при +4 С на 1 — 2 часа. После отстаивания смесь разделяется на два слоя: верхний — эфирный и нижний антигенсодержащий слой. Антигеп смешивают с иммуноадсорбентом в соотношении 2:1, выдерживают в течение ночи при +4 С и 1—

2 часа в термостате при 37 С. Затем иммуноадсорбент удаляют центрифугированисм при

1000 об/мин в течение 20 мип, Полученная надосадочная жидкость служит единым комплементсвязывающим антигеном, пригодным для РСК и РДП. Антиген можно консервировать азидом натрия в конечной концентрации

0,02%. В течение 3 месяцев антиген при +4 С не снижал активность (срок исследования) .

Предлагаемый способ приготовления антигенов из микоплазм имеет следующие преимущества: активность антигенов в РСК выше (1:64—

1:128), чем активность корпускулярного антигена (1:30 — 1:60); микоплазменные антигены активны, как в

РСК, так и в РДП. В РДП антиген выявляет большее количество прецинитирующих компо10 пентов, чем антиген для РДП, приготовленный с помощью термолизиса или ультразвуковой обработки; мико плазменные антигены, изготовляемые по данной методике, практически свободны от

15 антикомплементпых свойств.

1. Способ изготовления микоплазменного антигена для иммунологических реакций, включа1ощий разрушение биомассы микоплазм, отличающийся тем, что, с целью

25 получения антигена, пригодного одновременно для постановки РСК и РДП в агаровом геле, разрушение биомассы микоплазм проводят

1% -ным раствором Твина-40, который добавляют к биомассе в соотношении 1:10 в при30 сутствии равного объема этилового эфира, смесь встряхивают в течение 10 минут, выдерживают в течение 1 ч при +4 Ñ и удаляют образовавшийся верхний эфирный слой.

2. Способ по п, 1, отличающийся тем, 35 что, с целью удаления из антигена неспецифических компонентов, нижний образовавшийся антигенный слой обрабатывают иммуноадсорбентом в течение 24 ч при 37 С с последующим удалением его центрифугированием при

40 1000 об/мин в течение 20 мин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Биологические и химиотерапевтические

45 ветеринарные препараты, М, 1963, с. 357.

2. Васильева В. И. и др. Методы получения комплементсвязывающего антигена для лабораторной диагностики М. рпешпоп(ае — «Вестник Академии м иди цинских наук СССР», 5р 1969, Мз 5, с. 37 — 42,