Способ получения полимерных носителей протеинов

 

ОП ИСАНИ Е

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ

Я f

;. (ф«, С@аз Советскнх

СОциьлистич6ских

Республик

1 (и) f39930 (61),дополнительный, к патенту (51) М. Кл.т (22) Заявлено 19.02.75 (21)1898251/28-13/

/2106088/23-05 (> ) ПРиоритет 27.03 73 (3Z) ЗО.ОЗ.72

С 08 Р 222/04

Гааударстаенный немнтет

Совета Инннстроа СССР на делам нзабретеннй

Н NYKPblTNN (31)Р 2215539.1: (aa) фРГ (53) УДВ«678.744. .342 (088.8) (43) Опубликовано 25.01.7& Бюллетень № 3 (45) Дата опубликования описания 02.02.78

Иностранцы

Фритп Хюпер, Эрих Рауенбуш, Гюнтер ШмидтКастнер, Бруно Бймер и Xep6epr Бартл (яи) (72) Авторы изобретения

- Иностранная фирма

"Байер АГ (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНЫХ

НОСИТЕЛЕЙ ПРОТЕИНОВ

Изобретение относится к новым способам полимерных носителей протеинов«

Известен способ получения полимерных носителей протеинов путем бисерной сэполимеризации м, Р -моноолефинэвых ненасыщенных ангидридов дикарбоновой KBcJIoIû, преимущественно малеиновогэ ангидрида, с ненасыщенным соединением, а именно атиленом и, соединениями моновинила в среде эрганических растворителей в присутствии инициатора полимеризации при нагревании.

Однако сополимеры ангидрида малеинэвой кислоты с этиленом и соединениями монэвинила становятся при реакции с водными (5 растворами ферментов более или менее вода растворимыми, во избежание чего перед или во время реакции приходится 1добавлять сшивающий агент, например диамин. Полученные, аким образом ферментные препа«20 рати относительно плохо фильтруются и имеют растворимые части, чтэ приводит к потерям связаннэго фермента, Пель изобретения — создание способа получения полимерных носителей протеина, 25 обеспечивающего получение сшитых полимеровв.

Пель достигается благодаря гому, что в качестве ненасыщенного соединения согласно изобретению используют ди- или полиакрилаг или ди- или пэлиметакрилат ди- или

JIoJ7HolIoB в количестве 30-99% от веса о монэмеров и процесс проводят при 50-100 С. (x >P -М оноолефиновыми ненасьнненными ангидридами дикарбэновой кислоты с 4-9, предпочтительно с 4-5 атэмами углерода в молекуле, которые можно использовать для пэлучения сополимеров по предлагаемому способу, являются, например, ангидрид малеиновой кислоты, ангидрид итакоиовой кислоты, ангидрид цитраконовой кислоты, предпочтительно ангидрид малеиновой кислоты, Для сэполимеризации можно использовать смеси названных ангидридов.

Пригодные для сопэлимеризации по изобретению ди- и/или .полиметакрилаты, и дни/нли полиакрилаты ди- и/или полиолэв получают из соединений, имеющих не менее днуK алкогольных или фенэльных, предп эч титель-. но алкогольных. ОН-групп, илп продукт-в их

589030 реакции с алке нэкс»дами с 2-8, предпочтительно 2-4 атомам» углерода или сэ смесями таких алкенэксидов, причем к 1 мэлю несущих гидрэксильные группы соединений приполимеризовывают 1-10, предпочти4 тельно 1-20 алкеноксидных структурных элементов. В качестве пригодных алке»оксидов м Ожнэ назвать Окись этилена H Окись пропилена. Можно использовать также продукты реакции по Ыеревитинову соединений, содержащих не менее двух активных атомов водорода и полученных не из спиртов или фенолов, с вышеназванными алкенокси.дами с получением ди- и/или поли(мет)акрилат ов; 1$

Используемые согласно изобретению дни поли(мет)акрилаты ди- и полиолэв получают известными методами, например путем реакции ди- и/или полиолов с хлоридом (мет) акриловсй кислоты в присутствии примерно эквимолярных (в расчете на хлорид кислоты) . количеств третичных аминэз, например три, этиламина. Реакцию проводят при темперао турах киже 20 С в присутствии бенэола.

В качестве ди- и полиолов, содержащих не менее 2, предпочтительно 2-12 атомов углерода, можно использовать этиленгликоль, пропандиол-1,2; пропандиол-1,3; бутандиолы, в частности бутандиол-1,4, гександиолы, декандиолы, глицерин, триметилолцропан, ЗО пентаэритрит, сорбит, сукрозу и прэдукты их реакции с названными выше алкеноксидами. Пригодны также поли-бис-хлорметилоксациклобутан или полистиролоксид. Можно применять смеси ди- и полиолов. 35

Предпочтительно использовать диакрилаты и диметакрилаты диэлов, имеющих 2-4 атома углерода, и/или продукты реакции

1 мэля этих диолов с 1-20 молями алкеноксида с 24 атомами углерода в;молекулер 40 а также триметилпропантриметакрилат.

Ос обе нн о це лес о образ н о прим е ня ть диметакрилаты, этиленгликоля, диэтиленгликоля, триэтиленгликоля, тетраэтиленгликоля или высших полиалкенгликолей с мол. весом до 1000, а также смеси указанных с оединений.

Пр» желании .наряду с ди- и/или пэли(мет) акр»латами можно испэльээвать обычнэ применяемые сшивающие среды, имеющие «е менее 2 несопряженных двойных связей, а именно дивиниладипат„метилен-бис-акриламид> тр»акрилфэрмаль или триаллилц»аиурат примешиваемые в количестве

М примерно 0,1-30% От веса смеси мономеров.

Пользуясь возможностью весьма широко варьировать состав смеси мэномерэв, можно изменять гидрофильность, плотность сщ»вки, »абухаемэсть и содержание а»гидр»лиых групп B получаемых салол»мерах в соответствии с их конкретным»аз»анен»ем.

Сэполимеры по предлагаемому способу могут быть пэлучены, например, путем

Ф.:ад» тельной пэлимеризац»ч В Орга»»ческ Ом раствор»теле„причем пол»меры начинают выпадать вскоре после начала полимеризации.

В принципе пригодны любые»нертньте к ангидридным группам растворители. Наиболее целесообразно испольэовать алифатические, циклоалифатические, ароматические углев одороды, а также галогензамешенные угле:водорэды, алкилароматические вещества и сложный эфир карбоновой кислоты.

Примеры подходящих растворителей: гено тан, октан, иэооктан, фракции бензина, кипяо. шие примерно при 60-200 С, циклогексан, бензол, толуол, ксилол, хлорбенэол, дихлорбензол, этилацетат, бутилацетат.

Раствор»тели должны иметь точку кипения не менее 60 С и легко удаляться в вакууме иэ осажденного полимера. На 1 вес.ч. смеси мономеров применяют or 2 до 60, предпочтительно 5-20 вес.ч. растворителя, Ф

Вид и количество использованного растворителя существенно влияют йа насыпной вес, удельную поверхность и другие свсйства сополимеров. Во многих случаях желательно применять смеси названных растворителей.

Полимеризацию можно начинать в растворителе полимера, а потом непрерывно в- ходе полимеризации добавлять осадитель полимера;

Осадитель можно также вводить в определенные моменты одной или несколькими. порция ми. Смесь мономеров можно вводить вместе с подходящим инициатором (в виде расгвора или беэ раствэрителя) в определенное количество растворителя. Тогда в процессе полимериэации получается равномерная незна"чительная концентрация мономера. Применяя (мет) акриловые мономеры с разнс9 гидрофильностью и варьируя условия полимеризации, можно получать продукты с очень широким, сэответствуюшим их конкретному назна.чению, диапазоном набухаемости, плотности, удельной поверхности и с хорошей механической стабильностью.

Сополимеры по изобретению могут быть получены также методом суспензионнэй полимеризации. Наиболее часто применяемый вид бисерной полимеризации, в ходе которой мономеры (при необходимости с добавкой органических растворителей) суспендируют в воде, в данном случае мало эффективен,поскольку ангидрид очень быстро гидролиэуется, полученная дикарбоновая кислота переходит в основном в водную фазу и лишь в незначительной степени внедряется в структуру полимера. Суспензионную и Олимеризапию целесообразно поэтэму проводить в Орган»чсс589930

or 2 до 20 мл/г, удельной поверхностью

0,1-500, чаще от 1 дэ 400 м /г. Титрометрически определенное после омыления ангидридных групп содержание карбоксильных групп составляет or 0,02 до 10, преимущественно or 0,4 до 2 мг-акв./г.

Суспензионные полимеры представляют ñoбой белые иля слегка окрашенные бусинки, иногда неправильной формы, диаметром

0,03-1, чаше от 0,05 до 0,6 мм, с насыпным объемом около 1,4-8, чаше 1,4-5 мл/г.

Определенное после гидролиза ангидридных групп содержание гидроксяльных групп составляет 0,02 - 10, преимущественно or

0,4 до 4 мг экв/г.

Полученные по изобретению сополимеры содержат статистически распределенные сополимеризационные структурные элементы.

5 В связи с высокой плотностью пэперечных связей эти сополимеры не растворяются ни в каких растворителях, Их молекулярный вес не поддается поэтому определению.

Сополимеры набухают в воде до 1,1-2,5> кратной величины ях насыпного объема. Они прекрасно подходят для использэвания в качестве смол-носителей для фиксирования веществ, способных вступать в реакцию с ангидридными группами сополимеров.

Смолы-носители можно вводить при темо пера,уре от 0 до 30 С непосредственно в водный раствор связываемого вещества„ предпочтительно в водный раствор протеина; рН должен при этом поддерживаться на постоянном уровне.

Для связывания протеинов с сополимером целесообразно использовать рН-стат с уровнем рН or 3. до 10, предпочтительно от

5,5 до 9,0. При применении в качестве протеина пенициллинапилазы рН целесообразно поддерживать на уровне 5,7-6,8. Для поддержания постоянногэ рН в процессе реакции связывания необходимо непрерывно дэбавФлять основание. Для этого можно использовать неорганические основания, например растворы едких щелочей, и органические нэвания, например третичные органические амины.

Пример 1. 80 г тетраэтилеигликольдиметакрилата, 20 г ангидрида малеинэвэй кислоты и 1 г нитрипа азоизомасляной кислоты растворяют в 1 л бензэла и перемеэ шивают в течение 4 час при 60. С. Затем добавляют 1 r 1 нитрила аэоизэмасляной кислоты я 200 мл бензина (т,кип. 100кой среде. Мэномер я инициатор растворяют в несмачиваюшемся парафинами, инертном к ангидридным группам растворителе, например ацетэнитриле, диметилфэрмамяде,диметилсульфоксиде, триамиде.гексаметялфэсфорнэй кислоты, и распределяют — большей частью с добавкой диспергаторэв — и связанной фазе. В качестве связанной фазы наиболее пригодны парафиновые углевэдэроды, например гептан, октан и их высщиегэмолэги, g циклоалифатические соединения, например циклогексан,а также смеси парафинов, напри- . мер фракции бензина или парафиновое масло.

Объемное соотношение связанная фаза: мономерная фаза составляет от 1:1 до 10:1, 15 предпочтительно r 2:1 до 6:1.

Для стабилизации суспензия м ожно ис» пользовать, например, глицеринмон о- или диолеаты и их смеси, сорбитанмоно- и триолеаты и стеараты, простой мэноафир 20 полиэтиленгликоля со стеарил- или лаурилспиртом или нонилфенолом, сложный моноафир полиэтиленгликоля с олеиновой, стев-: риновой и другими жирнымя кислотами, сэ;держащими более 10 атомов углерода, а 2 также натриевые соли сложного диоктилового афира сульфэянтарной кислоты. Эти.вещества применяют предпочтительно в количестве 0,1-10% (в расчете на количество

} смеси мономеров); растворяются зни обыч- 3 но в углеводородной фазе. Величина частиц суспенэиэнных полимеров может быть уменьшена не только увеличением скорости перемешивания, но я добавкой 0,1-2,0% (в расчете на количество мономеров) дополнительного 55 поверхностно-активного вещества, например алкилсульфоната.

Полимеризация возбуждается радикальным инициатором. Пригодными инициаторами являю -40 ся азосоединения преимушественн нитрил аэоиэомасляной кислоты, или персоединения, глав- ным образом диацилперекиси, например дибензоилперекись, или перкарбонаты, например ,дииэопропил или дицнклэгексилперкарб онат 45

Для инициирования полимеризации можно также использовать диалкилперекися, гидроперекиси и эффективно действующие в органи вских растворителях окислительно-восстановительные системы, Инициаторы вводят в количестве 0,01-16, предпочтительно 0,1-3% эт веса смеси мономеров.

Полимеризацию осуществляют при темпера. о турах 50-100 С {в зависимости or скорости распада инициаторов), большей частью ниже температуры кипения растворителя. При

A бисерной полимериэации используется температура ниже температуры смешения обеих фаз,.

Желательно осуществлять полимеризацяю в атмосфере инертного газа, в отсутствие кислорода, Полученные путем осадительной пэлнмеризации сополимеры имеют слегка желтоватыйпвет или бесцветны. Это пэрошкээбразные вен ества с насыпным объемом от 1,5 до 30, чаше

5899 О

140 C ) . .Ыэлимеризацию продолжают еще э

5 час при 7 О С. о

Порошкоэбразный полимер отсасывают, взмучивают один раз в бензэпе и три раза в петродейнэм эфире (т. кип. 30-50 C) и сушат в вакууме. Выход 94 г.

Свойства полимера:

Насыпной объем, мл/г Зрй

Объем набухания в воде, мл/r 4,7

Удельная поверхность, м /г 5,0

Содержание карбоксипьных, групп после омыления ангидридных групп, мг-экв./г 3,5

Пример 2. Раствор 90 r этипенгпи копьдиметилакрилата, 10 г ангидрида мапеи, новой кислоты и 1 г нитрила азоизомаслянэй кислоты в 1 л" бензопа сначала переме= шивают при 60 C. Спустя 4 час добавляют.

200 мл бензина (т,кип. 100-140 С) и А г нигрипа азоизэмаспяной кислоты и цопимео ризуют еще 2 час при 70 С и 2 час при

80 С.

Полученный полимер- отсасывают, rmaтельно промывают петропейным эфиром

25 (т. кип. 30-50 С) и сушат в вакууме. Выход 97 г.

Свойства полимера:

Н ас ыпн ой объе м, мп;/г 6,4

Объем набухания в воде, мл/г 8,0

Удельная пэверхйэсть, м /г 298

Содержание карбэксипьных групп после омыдения ангидридных групп, мг-экв./г 1,5

Пример 3. В результате сопопимеризации 90 r диэтипенгликольдимегакрипага с 10 г ангидрида малеиновэй киспэгы в условиях цримера 2 получено 96 г продукта.t

Свойства полимера:

Насыпной объем, мп/г 5,5 ж

Объем набухания в aoäå, мл/г 6,7

Удельная поверхность, м7г 9 2

Содержапие карбэксильных групп после омыления ангидридных групп, мг-экв/ г 1,9,з

Пример 4. 80 г тетраэгипенгпиколь димегакрилага, 20 г ангидрида мапеинэвэг кислоты и 1 г пэрэфэра растворяют в 1 л бензопа и медленно перемешивают 16 час о при 80 С. Полимер подвергают обработке 50 аналогичной описанной в примере 1. Выход продукта 95 г.

Свойства полимера:

Насыпной объем, мп/г 2,5

Объем набухания в воде, мл/ r 3, О

Содержание карбоксипьных групп после омыпения ангидридных групп, мг-экв/г 2,6

Пример 5. В снабженном мешалкой сосуде нагревают в течение 1 час дэ 90 С о

7,3

8,2

19,4

1 r(бензина (-.кип, 100=140 С) и 1 r нетрида, азонзэмяспянэй кислоты, Затем rrp_#_ э т мперагуре 80 С в течение 3 час вводят цэ каплям раствор 95 г этиденгдикопьдимегакрилата„ 5 г ангидрида маленковой кислэ-! гы и 1 г ингрида азэизомаспяной кислоты и перемешивают при этой же температуре

BU1p. 2 ч ас, Полимер отсасывают многократно отмыва ют бензолом и петролейным эфиром (т.кип. 30

50 С) и сушат в вакууме, Въмод продукта 96 ".

Св ой с гва и олиме ра:

Насыпной объем, мл/г 15,0

Объем набухания в воде, мл/г 18,2.

Удельная поверхность, м /г 70

Содержание карбоксильных групп после омыпения ангидридных групп мг -экв/г 0,5 Пример 6. Раствор 62 5 г тетраэ иденгликольдиметакрилата, 37,5 r ангидрида малеиновой кислоты и 1 г нитрипа азоизомасдяной кислоты в 150 мд бутилаце» тата и 1 п бензина (г.кип. 100-140 С.)

o о перемешивают в течение 2 час при 70 С, 2 час при 75 С и 1,5 час при 90 С. о о

Полимер ргсасывают, экстрагируют в течение:24 час в экстракгоре Сокслега и сушат в вакууме. Выход продукта 77 г.

Св ойства полимера:

Насыпной объем, мл/г

Объем набуханияв воде, мл/г

Удельная поверхность, м /г r

Содержание карбоксильных групп после омыпения ангидридных групп, мг-экв,/г 4,0

Пример 7. Раствор 90 г тетраэтипенглнкольдиме1акрипага, 10 г ангидрида малеиновой кислоты и 1 г нитрила азоизомасляной кислоты в 200 мп ацетонигрипа суспено дируют в 1000 мл бензина (т.кип. 100-140 С)

/ в котором было растворено 5 г смеси гпицеринм оно-и диолеата. Реакционную смесь поли меризуют дэ образования твердых бусин околэ 2 час при 60 С и дополнительно 20 час о при 65 С. э

Полимер отфильтровывают, трижды промы вают бензолом и трижды петролейным эфиром о о (т.кип. 30-50 С) и сушат в вакууме при 90 С, Выход продукта со средним диаметром частиц около 0,35 мм составил 94 г.

Свойства полимера:

Насыпной объем, мл/г 2,8

Объем набухания в воде, мл/г 3,1

Удельная поверхность, м /г 3,4

Содержание карбэксильных групп после омыпения ангидридных групп,мг-экв./г 1,5

Пример 8, 18 г эфира диметакрипэвой кислоты ц окиси полипропилена с м ол. вес ом 1000 (число ОН-групп 112), 589930

2,5

Составитель В. Полякова

Редактор Г. Котельский Техред О. Андрейко Корректор М. Цемчик

Заказ 415/42 . Тираж 641 П одписн ое

11НИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

2 r ангидрида маленновой кислоты и 200 мг нитрила азоизомасляной кислоты помещают в ампулу, воздух вытесняют азотом и амлулу запаивают. После нагревания в течео ние 20 час до 65 С ампулу разрушают, полнмеризатный блок измельчают, трижды суспендируют в ацетоне н сушат при темо пературе 50 С н давленнн 50 торр. Выход полнмера 18 г.

Свойства полимера:

Насыпной объем, мл/г 2,3

Обьем набухания s воде, мл/г

Содержанне карбоксильных групп после омылення ан- %5 гндрндных групп, мг-экв./г 16

Ф ормула из обре те ния

Способ получения полимерных носителей протеинов путем бисерной сополимеризапии аС /3-моноолефнновых ненасыщенных ангидрндов дикарбоновой кислоты с ненасыщенным соединением в среде органических растворнтелей в присутствий инициаторов при нагревании, о т л н ч а ю шийся тем, что, с целью получения сшитых полимеров, в качестве ненасыщенного соединения нспол зуют дн- или полиакрилат или ди- или полиметакрнлат ди- нли полиолов в количестве

30-997 от веса мономеров и процесс проводят при 50-100 С. о