Способ приготовления туляремийной вакцины

 

Л 66621

Класс 30h, 6

СССР.ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Н. A. Гайс

СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ТУЛЯ

:Заявлено 12 ноября 1943 г. «а ¹;3 комиссариат вдравоохра

Известен способ Кудо (/ар. Journ Ехрег.,IIed т, XII, вы . 1, стр. 377 — 394, 1934) приготовления явируле»тной живой тулярем»йной вакцины, которая неспособна размножаться в организме. » поэтому эффективность ее низка и почти равняется эффективности убитой туляремийной вакцины. Этим объясняется то, что «вакцина» Кудo»е получила практического применения.

Предлагаемый способ приготовления слабо»»руле»твой ж»вой тулярем нинон 831(LIH»bl, которая в opl а пи ческ их 11 3cL» f 363 х р азл1ножается в тканях и по механизму действия может быть уподоблена самой эффективной из всех вакцино."пенной, также слабовпрулент»ой (аттенуированной), а не авирулентной вакцине.

Способ получения производственных вакциняльных шт;1л1мов заключается в том, что на ряд пробирок с желточной средой высепвается вирулентная туляремийная культура. Пробирки ставятся в термостят при температуре 37" и сохраняются без предохранен»я от высыхания. Время от времени отсюда делаются высевы Hil свежуго желточную среду. Последний штамм, полученный пр» длительном вь с; ill»âàíèè, снова засеивается на ряд пробирок и процедура повторяется снова. Процесс получения вакцинальных штаммов длится около 7 — 12 месяцев.

Полученные ослабленные штаммы испытываю1ся»я пммуногенность на белых мышах.

ЧерBз ме=яц BBKLLHHHpOBBHHhle >HHBOT»b!P II 1% f и :» l ко»тро, ib»OI O заражения 1000 минимальных смертель»ых доз вьрулент»ой тулярсмпйной культуры. В этом опыте определяется минимальная вакцинирующая доза, характеризующая иммуногенные качества данного штамма. Второй способ оценки иммуногенности полученных аттенулированных штаммов — определение минимальной приживающей дозй. Для этого ряду мь1шей вводятся под кожу различные разведения с различным содери<янием микробов данного штамма. Через 5 дней мышей убивают и вскрййают. Из всех органов делаются посевы на среду Чэк-Коя. Мини3Чо 66621 мальное количество микробов, которое с«особно приживаться в optaнизме животного и дать специфический рост на среде Мэк-Коя из органов мыши, получившей это количество микробов, будет минимальной приживающей дозой, характеризуюшей иммуногенные достоин тва штамма.

Пример приготовления и контроля жидкой живой туляремийной вакцины

I. Посевы культуры для изготовления вакцины I;IH изготовления туляремийной живой вакцины применяется однодвухсуточная культура производственного туляремийного штамма на желточной среде Мэк-Коя или цистиновом агаре с рыоным гидролизазом. Цист«новый агар необходимо выдержать после 2 — 3-суточно i проверки «а стерильность в термостате при температуре 37 не менее двух недель. а «ри комнатно"те,мпературе — от двух до трех недель. Среды— желточ«ая «ли цисти«оный агар — разливаются в флаконы или мат1эацы емкостью 100 см .

Перед посевом культуры ко«денсационная жидко=ть с соблюдением асептики отсасывается из флаконов и матрацев. Посев может производиться платиновой петлей густыми штрихами или закапыванием пипеткой маточной эмульсии со стандартом 8 — 16 млрд. микробных тел.

При посеве закапыванием эмульсия путем легкого покачивания распределяется равномерным тонким слоем по всей поверхности питательной среды в матрацах или флаконах и они отставляются в горизонтальном положении около 30 лан, по"ле чего могут быть переведены в вертикальное положение, но и могут быть оставлены в горизонтальном на все время нахождения в термостате.

В зависимости от интенсивности роста посевы выдерживаются в термостате от 24 до 48 час при температуре 37 . Термостаты должны быть проверены и отрегулированы на температуру 37, так как повышение температуры выше 37 может дать задержку роста штамма, изменение его свойства и гибель, наступающую при температуре 40 .

Маточная туляремийная эмульсия перед производ"твенным посевом микроскопируется и испытывается в реакции агглютинации на стекле с разведенной I:10 агглютинируюшей туляремийной сывороткой.

Рост культуры на желточной среде Мэк-Коя смывается незначительным количеством стерильного физиологического раствора (1 — 1,5 си раствора для смывания роста культуры с флакона со средой). Смыв отсасывается стерильно в пробирку. Можно в одну и ту же пробирку отсосать смыв из нескольких флаконов указанной выше емкости. Остатки маточной эмульсии в пробирке после производственного посева для контроля ез стерильности и условий производства засеваются на слабощелочной бульон. косой агар, полужидкий агар в количестве одной-двух капель

«а пробирку. Контрольные посевы помещаются в термостат. Через двое суток делается пересев с жидких сред на свежие жидкие.

11. Приготовление вакционной эмульсии

Рост туляремийной культуры на желточной среде Мэк-Коя или цистиновом агаре после 24 -48 час пребывания в термостате при температуре 37 смывается физиологическим раствором. Равномерным покачиванием флаконов или матрацев рост туляремийной культуры эмульгируется в смывающей жидкости, а затем она пастеровской пипеткой или сифоном отсасывается в стерильную пробирку или колбу. Нативная эмульсия микроскопируется для определения чистоты бактериальной

¹ 66621 взвеси, ставится реакция агглютинации с агглютинирующей туляремийной сывороткой в разведении 1:10 на стекле и сеется на слабощелочной бульон, косой агар, полужидкий агар и среду Мэк-Коя. Далее определяется стандарт нативной эмульсии по стандарту ЦГНКИ для микробов кишечной группы. При получении типичных для туляремийной культуры результатов, нативная эмульсия употребляется для изготовчения туляремийной вакцины.

ill. Приготовление жидкой туляремийной вакцины

24 — 48-часовая туляремийная культура на среде Мэк-Коя или цистиновом агаре смывается стерильным физиологическим раствором, смыв отсасывается, в зависимости от количества нативной эмульсии, пастеровской пипеткой в пробирку или сифоном в стерильную кочбу.

Затем нативную эмульсию микроскопируют, стандартизируют и тавят реакцию агглютинации с туляремийной агглютинирующей сывороткой.

Кроме того делается посев нативной эмульсии на обычные питательные среды (слабощелочной бульон, косой агар, полужидкий агар) и среду

Мэк-Коя. После определения стандарта нативной эмульсии и получения результатов микроскопирования и реакции агглютинации на стекле приступают к приготовлению жидкой туляремийной вакцины. Нативная туляремииная эмульсия разводится стерильным физиологическим раствором до стандарта 50 млн. микробных тел 1 си (для взрослых) и до !О млн. в см (детская вакцина) и разливается по 25 — 50 си в стерильные ампулы нейтрального стекла. Запайка ампул производится вслед за разливкой или разлитая продукция, закрытая ватными пробками, выносится в запаячную для запайки. Бактериологический контроль разведенной вакцины производится посевом ее на обычные питательные среды и среду Мэк-Коя:

1) непосредственно вслед за разведением вакцины и

2) в процессе разливки вакцины (в начале, середине и конце разливки).

Через 3 дня после разливки делается посев из нескольких ампул

*(2 — 3) .

Жидкая вакцина в ампулах подвергается физическому контролю на присутствие микроскопических примесей (ваты, стекла, песка. пригари от запайки и т. д. ). Ампулы, содержащие посторонние примеси, бракуются.

Контроль на безвредность. Для контроля на безвредность пользуются морскими свинками, которым вводят подкожно 4 — 5 см готовой жидкой вакцины. В случае гибели животных производится патолого-анатомическое вскрытие для установления причины гибели. Опыт повторяется.

Контроль иммуногенных свойств. Для контроля иммуногенных свойств проводят однократную вакцинацию готовой жидкой вакциной белых мышей или морских свинок с последующим заражением иммунизированных животных 1000 минимальных смертельных доз живой вирулентной туляремийной культуры (порядок работы изложен выше).

Жидкая туляремийная вакцина хранится в сухом, темном месте на льду при температуре 0 — 2 . При этих условиях срок годности ее 20 дней.

Вакцина пересылается в термосах, куда закладывается лед с поваренной солью.

Работа в лаборатории по производству живой туляремийной вакцины производится по общей бактериологической и производственной методикам без коррективов, вводимых в методику режимом противо-чумных и туляремийных учреждений. Режим работы и условия произ№ ббб21

Водства (помещение, внутренний распорядок) соответствуют тем !р бованиям, которые предъявляются к лаборатории, выпускающим живые вакцины ЕВ и ЬЦ)К.

Пример приготовления сухой живой туляремийной вакцины

Натнвная эмульсия готовится так >ко, как и для жидкой вакцины, только смыв делается не физиологическим раствором, а 57о-ным раствором желатины. Бактериологический контроль нативной эмульсии на загрязнение посторонними микроорганизмами производится в начале, сереДИНЕ Н KOFI1IP. РаЗЛИВКИ ЕЕ В BivI11)ЛЬ! ПОСЕВОХI ОДНОИ-ДВУХ КаПЕЛЬ ЭМУЛЬсии на обычные применяющиеся для этой цели питательные среды.

Проконтролирова!шая на бактериальную чистоту и специфичность (реакц1!я агглютинацип) нативная эмульсия разливается градуированной пипеткой в 1 — 2 с,из с оттянутым концом в ампулы нейтрального стекла. Лмпулы и ãîòîâëÿþòñÿ из стекла «Пирекс» или дрота марки

¹ 23 и имеют в середине перетяжку. Открытый конец ампулы закрывается ватной пробкой. Градуированные пипетки меняются ilo мере их использования. Набирать одной пипеткой нативную эмульсию дважды не рекомендует=я во избежание бактериа",üíîãî загрязнения нативной эмульс!!и. При наличии большого количества нативной эмульсии разливка .по ампулам производится прибором (сифоном) с «колокольчиком» и приспосооленисм для отмеривания определенного количества эмульсии.

Практи ески нат1!Внс! я э. ульс!!я разл!1Вается в амllулы в I 0;!ичестве 1,0 — 2,0 с.!! . Послс разливки в ампулы нативная эмульсия поступаег для вы:ушивания в вакуум-аппарат тина флосдорфа, Высушивание эмульсии производится с замораживанием или без него. Ампулы с нативной эмульсией погружаются в мелкораздробленный лед, !!еремешанный с поваренной солью, и выдерж1гваются в нем 20- 30 11ия., го есть пока содержимое ампул не замерзнет. После этого включается масляный насос и, как только гакуум В аппар те достигнет не ниже р=-0,098. лед убирается. Вакуум быстро поди!!мается, через 40 — -50 !!ин достигает р 0,035 — 0.032 и сохраняется на этом уровне на протяжении всего периода работы аппарата. Высушиванне нативной эмульсии продолжается 18 — 24 час, после чего производится запайка ампул. Если

11роцесс с1 1к11 идет Оез замораж11ванР!я, то Отпа Iает процесс погружения ампул с нативной =.ìóciücèåé в лед. и онп сразу подвергаются действию высокого вакуума р 0,035 — 0,032 в течение 18- -24 час. После этого ампулы идут на запайку. В обеих случаях высушивания--как с замораж!!Ван1!ем, так и без него — запайка ампул происходит в условиях высокого вакуума. Лмпулы с сухой натнвной эмульсией контролируются тщательным осмотром на герметичность.

KoHTpoJIb ПЭМ на растворимость. Ампула с высушенной нативной эму;!ьсией В крывается с соблюдением прави;! асептvKH. Содержимое эмульгируется В физиологическом растворе и осторожно отсасывается

В пробирку, в которую добавляется физиологический раствор в количестве, неооходимом для получения стандарта 100 млн. микробных тел в 1 см . Пробирка дол;кна быть чистая, прозрачная и не должна содержать посторонних примесей. После растворения сухой бактериальной массы должна получаться однородная, гомогенная вакцинальная эмульсия без хлопьев и прочих включений. Нормально сухая нативная эмульсия растворяется в течение 3 — 4 мин.

Микроскопия. Капля эмульгированной в физиологическом растворе нативной эмульсии из ампулы распределяется тонким слоем на пред! етном стекле, фиксируется алкоголем и скрашивается по Гимза или

)ук ином Пфайфера.

Бактериологический контроль. На следу;ощий день после запайки тбираются образцы из запаянных ампул, которые проверя!отея предарительно на герметичность запайки. Затем ампулы в количестве — 3 шт. вскрываются с соблюдением правил асептики. При помощи латиновой петли в ампулу закапывается о на капля стерильного фииологического раствора, сухая масса, прилипшая к влажной петле, еется легким втиранием на обычные пи!ательные среды и среду Мэк,оя. Посевы выдерживаются в термостате двое суток, после чего де- ается пересев из пробирки слабощелочного бульона на косой агар и

l3 пробирки полу>кидкого агара — на полужидкий. Контрольные посеы выдерживают дополнительно двое суток (всего пять суток).

Контроль Ila отмирание микробов до высy»!III,a!I!Is! нативной эмульии и после высушивания осущест!з.!яется определением минимальной акцз!н!!р !Оп!ей )031, исходя из ТОГО пслсжcllliB, ч I О только )hIIBQII ми!<оо способен вакцинировать и создавать иммунитет. Опыт проводится бе Iblx мышах; которым BBQ HTcH 1103 кожу р lзличные ho;IllчеcTI33 икрсбов. Разведения делаются, исходя из количсст!за х!икробс", у;.3—

3HHOI 0 HB этикеTHB B!vill), bl. ЧеpC3 I CH Il, )hHBOT;l I I! 3) T в Опыт 1 снтольного заражения. Разница в вели !и!ц вакшширующей дозы до и попе высуши!зания даст представление 00 отм!!рании и 0 качест!зе и имуногенности данной серии сухой вакцины.

Контроль на без!зредность HpOBO;III ãñ» JI;. з!Орскпх свинках. В этом

) i IBE . мсрск01! cB! Ill h33 I)ессм 500 г BBO Lll cH псдкож!!с 500 млп. миз;рс38 и3 co)e1))hH)!Ohio aAIIJxlbl. В cB) чае Гибели OIlbJTHblx.)hcHB0THblx Нрозводит:я патолого-анатомическое вскрытие для установления причиы гибели и опыт повторяется.

Для контроля на иммуногенность употребляются наиболее восприячивые к туляремии опытные животные: белые мыши или морские зинки.

1. Белые мыши.,зесяти белым мышам весом по 18 — 20 г вводится одксжно по 25 микробов сухой JJBTHBIIOII эмульсии, разведенной стезл! ным физиологическим раствором. Через 30 дней животные заражатся подкожно 1000 минимальных смертельных доз живой вирулент)Й туляремий ной культуры.

Учет результатов производится через )5 дней после заражения. акцина, давшая 60О!о выживаемости при абсолютной смертельности, .итается пригодной для целей иммунизации.

2. Морские свинки получают подкожпо Ilo 5000 микробов эмульгп-! ванной в физиологическом растворе сухой нативной эмульсии. Раздение делается до указанного стандарта. Сухая вакцина, разведенная физиологическом растворе, вводится пяти морским свинкам весом по 0 г. Через 30 дн . морские свинки заражаются подкожно 1000 ми1мальнь!х смерте I:-Hblx доз для них живой вирулентной туляремийной льтуры.,Животные наблюдаются в течение 15 дней. Вакцина, давшая 1о выживаемости, считается иммуногенной.

Предмет изобретения

Способ приготовления туляремийной вакцины из живых, слабо вилентных оактерпй путем длительного культивирования и пересева

)збудителя туляремии на подсыхающих средах при температуре 37, л и ч а ю щ ий с я тем, что ослабление вирулентности культуры довот до такого состояния, когда последняя становится авирулентной пс ношению к морским свинкам, сохраняя определенную вирулентность .отношению к оелым мышам.