Способ получения фермента -1,6 глюкозидазы
И С А Н И Е („,бтт5о, ИЗОБРЕТЕН ИЯ
Союз Советских
Социалистиыеских
Республик (61) Дополнительный к патенту (22; Заявлено 10.01.75 (21) 2101415/28 — 13 (23) Приоритет — (32) 11.01.74 (51) Я, 1(.
С 12 0 13/10
Государственный комитет
Совета Министров СССР по делан нзооретений н открытий (31) 6465/74 (33) Япония (43) Опубликовано 15.06.78. Бюллетень № 22 (45) Дата опубликования описанияИ.05.78 (Я) УДК 5771507 (088.8) (72) Авторы изобретения
Иностранцы
Есиюки Такасаки и Есимаса Такахара (Япония) (71) Заявитель
Иностранная Фирма
"Эидженси оф Индастриал Сайенс энд Текнолоджи" (Япония) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА а — 1,6 — ГЛЮКОЗИДАЗЫ
Изобретение относится к вопросам биохимии, а именно к способам получения а-1,6-глюкозидазы и,в-амилазы одновременно.
Известен способ получения а-1,6-глюкозидазы путем культивирования микроорганизмов, принадлежащих к роду Bacillus на питательной среде, в которой в качестве источников углерода и азота используют продукты неполного гидролиза крахмала или мальтозы и гидролизат железа или смесь их с солью аммония (1). При этом поддерживают температуру среды на уровне 30 С и рН 7,0 — 7,3.
Известен также способ получения Р-амилазы с IIQMoIHbie микроорганизмов, относящихся к разновидности Bacillus, например Bacillus ро угпуха. Bacillus megaterium.
Таким образом, известные способы получения 15 а-1,6-глюкоэидазы и р -амилазы независимые, предусматривающие использование не одной и той же культуры, а различных.
Как известно, е-1,6-глюкозидазу и Р-амилаэу используют при производстве мальтозы из крахмала, которое ведут двумя стадиями: на первой стадии обеспечивают воздействие на крахмал первого фермента, а на второй — второго.
Таким образом, для получения указанньк энзимов культивируют соответствующие микроорганизмы по отдельности, а при осуществленйи 25 процесса получения мальтозы создают различные условия для осуществления последовательно двух производственных стадий. Все эти недостатки усложняют процесс.
Целью изобретения является разработка способа, обеспечивающего получение одновременно с ферментом а-1,6-глюкозидаэа фермента Р-амилаза.
Для достижения указанной цели из рода Ва
cillus для культивирования на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минераль. ные соли, при работе по прецлагаемому способу используют штаммы Bacillus cereuc var. mycosi.
des (РЕЯМ У 2391) или Bacillus sp УТ 1002 (FERM Р 2837) или Bacillus sp. УТ 1003 (FERM
Р 2838) .
Bacillus cereus была представлена Fermentation Research Jnstitute of С!нЬаshi, 1арап согласно . РЕЯМ N 2391 20 декабря 1973 г, Bacillus
sp. УТ 1002 и Bacillus sp. УТ 1003 были представлены этим же институтом 12 декабря 1974 r согласно FERM Р 2837 и FERM N 2838.
Ниже представлена характеристика этих микроорганизмов.
Baci I t us cereus липоидная разновидность (РЕЯМ N 2391) ° Палочка размером (1,1 — 1,4) х х (4,2 — 7,0) мкм, обычно находящемся в длинной или короткой цепи подобно плесени или Acti611596
nomyces. Неподвижная, грам-положительная, спораигии беэ ощутимого разрастания.
Питательный бульон. Хороший рост, осадок.
Питательный косой агар. Обильное прорастание. филаментный, распределен по поверхности, кремовато-белый.
Глюкозо-аспарагиновый агар. Нет хорошего роста. Филаментный.
Глюкозо-нитратный агар. Нет роста, а если есть — очень незначительный.
Тиразиновый косой агар. Хороший рост, филаментный, слегка коричневый.
Использование цитрата. Положительное.
Молоко. Пептонизация.
Картофель. Хороший рост, желтовато-белый, слегка коричневый.
Желатин. Разжижает.
Получение аммиака. Положительное, Получение ацетилметилкарбинола. Положительное.
Восстановление нитрата до нитрита. Отрицательное.
Каталаза. Положительная.
Получение индола. Отрицательное.
Гидролиз крахмала. Положительный.
Бульон с NaCl. В бульоне с 4% NaCI не развивается.
Bacillus sp. УТ 1002 (FERM N 2837).
Палочка размером (1 — 12) х (5 — 6) мкм, не.подвижная, грам-положительная, встречающаяся в виде короткой или длин гой цепи.
Йитательный бульон. Осадок.
Питательный косой агар. Незначительный рост.
Молоко. Медленная пептонизация.
Картофель. Хороший рост, распределяется по поверхности, желтовато-белый.
Желатин. Разжижение.
Получение аммиака. Положительное.
Восстановление нитрата в нитрит. Положительное.
Каталаза. Положительное.
Ацетилметилкарбонил. Производится.
Цитрат натрия, Незначительный рост.
Органический источник азота. Необходим для роста.
Карбогидрат. Из глюкозы, фруктозы, галактозы, манноэы, лактозы, сорбита, глицерина, трегапоэы, крахмала и гликогена образуется кислота, а не газ.
Температура роста. Произрастает при температуре не выше 50 С, оптимальная температура 3035 C.
Эта культура выделена иэ почвы.
Bacillus sp. УТ 1003 (FERM N 2838).
Палочка размером (1-1,6) х (2 — 7)мкм, неподвижная, грам-положительная, встречается в виде короткой или длинной цепи.
Питательный бульон. Хороший рост, образу10
Питательный косой агар. Хороший рост, рас. пределяется по поверхности, желтовато-белый.
Глюкоза-аспарагиновый arap. Незначительный рост.
Молоко. Пептонизация без коагуляции.
Желатин. Медленное разжижение.
Получение аммиака. Положительное.
Ацетилметилкарбинол. Производится, Цитрат. Используется как источник углерода.
Карбогидрат. Глюкоза, фруктоза, галактоза, манноза, а-арабиноза, О-ксилоза, лактоза, сукроза, мальтоэа, трегалоза, раффиноза, маннит, сор. бит, глицерин, инсулин используются без образования газа.
Температура роста. Максимальная 45 С, оптимальная 30 — 33 С.
Культура выделена из почвы.
Предлагаемый способ заключается в следующем, Одну из указанных культур культивируют в среде, включающей источники углерода и азота.
В качестве первых используют мальтоэу, крахмал, гидролизаты последнего (декстрин), в качестве вторых — пелтон, казеин, экстракты мяса, дрож25 жей, воду после эамачивания зерна, сено, соевый жмых.
Источники азота при необходимости пополняют неорганическими солями — фосфатом, солью магния, солью бария и солью кальция.
30 В случае использования воды после замачивания зерна из нее предварительно удаляют вещество, ингибирующее образование р-амилазы.
Для увеличения выхода а-1,6-глюкоэидаэы и Р-амилаэы добавляют в среду соли марганца или
35 различные его соединения, например сульфат марганца. В первом случае соли марганца добавляют в среду в количестве порядка 1х10 — 1х10 моля, во втором случае соединение марганца добавляет в среду в количестве порядка 1х10 моля.
40 В среду добавляют цитрат и/или тартрат в количествах порядка 0,01 — 1%. При использовании цитрата или тартрата натрия их вносят в среду в количестве 0,1%. В среду добавляют также (для увеличения выхода ферментов рапсовое семя, 45 рапсовый жмых, экстракт.
Культивируют бактерии в условиях аэрации при 20 — 40 С в течение 24 — 72 час.
При культивировании рН среды меняется от 5,5 до 9,5, оптимальное значение 6 — 8.
Полученные энзимы имеют ячеистую структу. ру, Их регенерируют фильтрацией культуральной жидкости, затем фильтрат концентрируют путем добавления ацетона, этанола, метанола или изопропанола и образования осадка. Для осаждения применяют также сульфат аммония. Получают р-амилаэу и а 1,6-глюкозидазу в смеси в виде ocagка, насыщенного сульфатом аммония.
Для регенерации ферментом используют также такие адсорбенты, как крахмал, активировани 3
611596
Ял / О ъаз зтлафо 3 ФътГътъОР ОРИЙЯ 1 твс с о тов с помощью крахмала улучшается, если его предварительно нагреть до 40 — 65 С.
Адсорбированную р-амилаэу злюируют раствором, содержащим 1 — 10% мальтоэы, или раствором, содержащим растворимьгй крахмал, декстрин, мальтозу. Адсорбированные на активированном утле энзимы могут использоваться как связанные эн зимы.
Так, Р-амилаза адсорбнруется в количестве
8000-12000 единиц, а а-1,6-глюкозидаза в коли- 10 честве 500 — 1000 единиц на 1 г активированного угля. Адсорбированные энзимы сохраняют свою активность на уровне 90 — 100% от ее первоначального значения.
Ферменты хорошо адсорбируются и на диатомовых веществах, например перлите, и сохраняют в таком состоянии активность на высоком уровне (50 — 70% от первоначального значения) .
Характеристики энзимов — P-амилазы и а- 16-глюкозидазы, полученных описываемым спосо- 20 бом, приведены ниже.
Р-.Амилаза.
Действие. Энзим производит мальтозу из крахмала, амилозы, амилопектина, гликогена, декстрина и др. 25
Специфичность в отношении воздействия субстрат. Степень гидролиза мальтозы в амилозу ближе к 100% и крахмала в мальтозу к 6№ Энзим не гидролизует а-1,б-глюкозидазную связь, которая содержится в амилопектине, гликогене, декстрине и т.п. рН реакции составляет 3 — 10, оптимальное значение около 7,0.
Температура реакции до 65 С, оптимальная около 50РС.
Дезактивация. Около 20% активности теряется через 10 мин пребывания при 55 С. При 70 С через 10 мин наступает полная дезактивация. рН вЂ” Устойчивость. Энзим неустойчив в кислой среде при рН ниже 5,0. Стабилен в интервале рН 6--10,0.
Ингибирование. Ингибируется и-хлормеркурбензоатом и в некоторой степени монойодацетатом.
Активность после ингибирования и- хлормеркурбензоатом восстанавливается путем добавления
45 цистеина.
Ф+
Сильно ингибируется ионами Cu Hg Ag, а также ионом Fe
Способ очистки. Энзим фракционируют путем осаждения из культурального бульона в результате насыщения 30 — 50% сульфата аммония с последующей высокоэффективной очисткой на хроматографической колонке с использованием Sephadex
G-100.
Измерение активности энзима. Энзимный
55 раствор вносят в 2 мл 0,1 К раствора фосфатного буфера (рн 7,0), содержащего 2,0% растворимого крахмала, и доливают дистиллированную воду до общего объема 4 мл. Смесь инкубируют при
60 начала реакции производит 1 мг мальтозы, обозначают как 1 единица. а. 1,6- Глюкозидаза.
Действие. Этот энзим гидролизует а 1,6-глюкозидазную смесь амилопектина, который уже был в некоторой степени гидролизован Р-амилазой, Специфичность по субстрату. Энзим производит мальтотриазу путем гидролиза а- 1,6- глюкозидазной связи пуллулана. В случае реакции с амилопектином ие наблюдается усиления йодной красящей способности. Энзим проявляет активность на амилопектине, предварительно гидролизованном в некоторой степени р-амилаэой. Энзим не действу. ет на изомальтозу. рН реакции в пределе 5 — 10, оптимальное значение около 6 — 6,5.
Температура реакции около 50 С, оптимальная около 50 С, Дезактивация. Около 50% активности теряется после 10-минутной выдержки при 50 С, Полная дезактивация наступает через 10 мин пребывания при 65 С. рН-Стабильность. Энзим устойчив при рН 6-9, нестабилен в кислой среде и относительно устойчив в щелочной.
Ингибирование. Энзим в некоторой степени ингибируется и- хлормеркурбензоатом и незначительно. — монойодацетатом. Значительное ингибиру++ ++ ющее действие оказывают ионы Hg и Ag, ингиЧ. + бируется также ионом Fe
Способ очистки. Энзим фракционируют из культуральной жидкости путем осаждения 60 — 70% сульфата аммония с последующей очисткой иа хроматографической колонке с использованием
Sephadex G-100.
Измерение энзимной активности. Активность измеряют по реакции, при которой в качестве субстрата используют пуллулан. Энзим производит из пуллулана мальтотриозу. Дпя этого некоторое количество энзима добавляют к 0,5 мл 0,1 M раствора фосфата буфера (рН 7,0), содержащего 1% пуллулана. Смесь доводят до общего объема порядка 0,1 мл дистиллированной водой. Затем ее инкубируют при 40 С в течение 60 мин, Количество энзима, которое производит 1 мг мальтотриозы, обозначают как 1 единица.
Из препарата можно независимо выделить
Р-амилазу и а-1,6-глюкозидаэу. Для этого жидкость насыщают сульфатом аммония до концентрации 30 — 50%. Происходит осаждение Р-амипазы. 3атем насыщают жидкость сульфатом аммония до концентрации 60 — 70%. При этом осаждается второй энзим. Полученные энзимы очищают на колон. ке, заряженной Sephadex.
Пример 1. В эрленмейеровскую колбу емкостью 200 мл помещают 50 мл среды, содер. жащеи 1% пептона, 0,3 КрНРО4 0,1 М9$04 7НзО и I мальтозы. Стерилизуют обычным способом, в среду вносят микоиды разновидности Bacillus
r÷*ãe с (FFRM М 2391) и культивируют при 30 С
611596 в ечение двух дней. После культивирования из культурального бульона центрифутированием удаляют клетки. Затем всплывающий слой исследуют для определения количества полученных энзимов. В результате было получено 628 единиц Р-амилазы и 18 единиц а-1,6-гликоэидазы, считая на 1 мл среды.
Культуральный бульон помещают в целлофановую трубку и диализируют по отношению к дистиллированной воде для того, чтобы удалить ос- 10 таточный сахар.
Часть указанных диализированных энзимов (в которых содержалось 204 единицы Р-амилазы и
5,6 единиц а-1,6-глюкозидазы) приводят во взаимодействие с картофельной амилазой, амилопектином картофельным крахмалом, гликогеном и декстрином, каждый из которых был взят в концентрации 4% при рН 7 и 40 С (общий реакционный объем составлял 4,3 мл).
Через постоянные промежутки времени отбирают пробы реакционного раствора, каждую из которых. берут в постоянном количестве, и в них определяют количество редуцирующего сахара по методу Somogyi Nelson. Состав сахара в реакционной смеси определяют с помощью метода хроматографии на бумаге (4 ч. пиридина, 6 ч. бутанола и
3 ч. воды) . В результате установлено, что образовавшийся сахар почти полностью представляет собой мальтозу (90 — 96%), в том случае когда амилоза, амилопектин„картофельный крахмал использова- 30 лись в качестве субстрата и в конечном реакционном растворе наблюдали очень небольшое количество сахара, имеющего Rf, соответствующий мальтотриозе (4 — 8%). В результате испытания с помощью
Hucostat (производимого Vorthington Biochemical M
Corporation U.$.А ) было установлено, что образование глюкозы происходит в черезвычайно небольшом процентном количестве (менее 0,1%). Картофельная амилаза, амилопектин, декстрин и картофельный крахмал, испытанные таким образом, 40 практически нацело гидролизуются в мальтозу через 8 час реакции. Гликоген также гидролизуется не менее чем на 90 o в мальтозу через 23 час реакции.
Пример 2. В среду, имеющую такой же состав, 45 что использовался в примере 1, инокулируют Baci l I us
sp. УТ 1002 (FERM Р 2837) и подвергают культивированию со встряхиванием при 30 С. Через
48 час культивирования в культуральном бульоне определяли количество образовавшихся энзимов. 50
Было получено 121 единица Р-амилазы и 10,5 единиц а-1,6-глюкозидазы на 1 мл бульона.
Пример 3. В среду того же, что и в примере,1, состава инокулируют Bacillus sp,ÓÒ1003 (FERM Р 2838) и подвергают культивированию со встряхиванием при 30 С. Через 48 час культивирования в культуральном бульоне определили количество образовавшихся энзимов. В результате получено 152 ч, Р-амилаэы и 5,3 ч. а-1,6-глюкоэидазы
1 Д
Пример 4. В колбу емкостью 1 л помещают 250 мл среды, содержащей (%) 1 полипептона, 0,3 Кэ НР04 О 1 М9$04 ° 7НэЬ и 1 декстрина, и подвергают ее стерилизации по обычной методике. Затем среду инокулируют микоидами разновидности Baci I I us cereus и проводят культивирование ее встряхиванием при 30 С. Через 48 час культивации культуральный бульон центрифугируют для удаления клеток и полученный всплывший слой испытывают на энзиматическую активность.
Было получено 420 единиц Р-амилазы и
7,8 единиц а-1,6-глюкозидазы на 1 мл бульона.
В 200 мл (часть указанного культурального бульона) вносят до 75% сульфата аммония и полученную в результате осажденную фракцию центрифугируют и растворяют в небольшом количестве воды, а полученный в результате раствор испыты. вают на энзиматическую активность. В результате получено 83000 едшиц р-амилазы и 952 единицы а-1,6-глюкозидазы.
Пример 5. Часть раствора энзима, полученного в примере 1 и. состоящего из 10000 единиц Р-амилазы и 275 единиц а-1,6-глюкозидазы, приводят во взаимодействие с 1 г амилопектина при концентрации 1% в присутствии 5х10 эМ СаОэ.
Реакция протекает при 40 С, рН среды при этом поддерживают на уровне 7. Редуцирующий сахар в реакционной смеси определяют по методике
Somogyi Nelson. Получено 972 мг мальтозы. Количество полученной глюкозы составило 3,7 мг.
Путем бумажной хроматографии обнаружено пятно мальтозы и пятно, соответствующее очень небольшому количеству мальтотриозы.
П р и м е о 6. Приготовляют среду, содержащую (%) 1 полипептона, 1 декстрина, 0,3 Кр НР04 и 0,1 М980, 7Н,О, а также среду, полученную в результате добавления к укаэанной среде различных количеств (1х10 7 — 1x10 моли) сульфата марганца, как показано в табл. 1. Эти среды помещают (каждую объемом 50 мл) в эрленмейеровскую колбу объемом 200 мл и стерилизуют по обычной методике. После этого среды инокулируют микоидами равновидности Bacillus cereus u подвергают культивированию в условиях аэрации при 30 С в течение 42 час.
После культивирования культуральный бульон центрифугируют и верхний слой подвергают испытанию на содержание образовавшихся Р-амилазы и а-1,6-глюкозидазы. Результаты представлены в табл. 1.
Как следует из табл. 1, добавление сульфата магния повышает количество полученной е-1,6-глю. козидазы приблизительно в 3 раза.
Пример 7. В эрленмейеровские колбы емкостью 200 мл помещают 50 мл среды, содер. жащей (%) 1 полипептона, 0,3 КэНРО4 и 0,1 MgSO<< х7НэО, и стерилизуют. Затем среду инокулируют микоидами разновидности Bacillus cereus и под.
611596
30 С. На 24-м часу культивирования, когда количество р-амилазы составило 237 единиц на 1 мл среды, в среду стерильно добавляют сульфат марганца в количестве 1х10 ", считая на количество среды, и продолжают культивацию.
На 42-м часу культивирование прекращают.
Культуральный бульон центрифугируют для удаления из него клеток и полученный в результате всплывший слой испытывают на Р.амилазную и а-1,6-глы»коэидазную активности. Результаты этого испытания представлены в табл. 2.
Соль марганца, добавленная в среду в середине культивирования, повышает количество полученной а-1,6-глюкоэидазы приблизительно в 1,7 раза и благоприятствует образованию Р- амилазы. Когда культивирование осуществляют в среде, содержащей марганцевую соль с самого начала, количество полученной а-1,6-глюкозидазы повышается приблизительно в 2 раза по сравнению с количеством, которое может быль получено без добавления соли 20 марганца, а количество полученной р-амилаэы понижено, всего лишь 28,8 единиц на 1 мл.
Пример 8. Готовят среду, содержащую (%) 2 полипептона, 0,3 К НРО4, 0,1 MgSO4 7Н О и 5-10 М CaCI, а также среды, полученные в ре- 25 зультате добавления к указанной среде цитрата натрия в количествах, соответствующих концентрации 0,5 и 1%, и среды, полученные в результате добавления тартрата натрия к укаэанной среде вколичествах, отвечающих концентрации порядка з0
0,25 и 0,5%. В эрленмейеровские колбы емкостью
200 мл помещают среды (в количестве 50 мл) и стерилизуют по обычной методике. В среды инокулируют микоиды разновидности Bacillus
cereus и подвергают их культивированйю при 30 С в течение 42 час.
Затем культивируют, жидкость из каждой колбы центрифугируют и полученный в результате всплывший слой подвергают пробе на определение Р-амилазной и а-1,6-глюкозидазной активности.40
Полученные в результате данные представлены в табл. 3.
В том случае, когда культивирование осуществляют в среде, содержащЕй рапсовый жмых, 45 количество полученной а- 1,6- глюкоэидазы приблизительно в 2,4 раза превышает То количество, которое получается в среде, не содержащей рапсового жмыха.
Культуральный бульон, полученный в результате культивации в среде, содержащей рапсовый жмых, центрифугируют для удаления клеток. 2 л полученного всплывшего слоя объединяют с 4 л холодного этанола. Полученный осадок отделяют фильтрацией, а затем сушат. В результате получен порошкообразный энзим, состоящий из 115800 единиц Р-амилазы и 4640 единиц а-1,6-глюкозидазы на 1 г, что указывает степень регенерации р-амилазы 75%, а степень регенерации а-1,6-глюкознцазы — 60
Добавление солей органических кислот заметно повышает количества полученных Р-амилазы и а-1,6-глюкозидаэы.
Пример 9. В два баночных ферментатора емкостью 10 л помещают среду, содержащую (%) 4 молочного казенка, 0,3 КэНРО и 0,1Му$0,»Х л7Н О и 5 10 М Сас!, а также 0,5 растворимого крахмала, причем в каждый ферментатор загружают по 0,5 л. В один из двух ферментаторов добавляют рапсовый жмых в количестве, соответствующем 4%, считая на вес среды. Затем среды двух ферментаторов стерилизуют 30 мин при 121 С.
После этого среды инокулируют микоидами разновидности Bacillus cereus (100 мл) и осуществляют культивирование в условиях аэрации при 30 С при подаче воздуха с объемной скоростью порядка 5 мин при перемешивании со скоростью порядка 250 об/мин. Через 24 час культивации культуральный бульон центрифугируют и полученный в результате всплывший слой подвергают испытанию на энэиматическую активность. Полученные ре- ° зультаты представлены в табл. 4.
Нагревают до 60 С 30 мин. К полученному раствору добавляют 300 мл фильтрата культуры микондов разновидности Baci l l us cereus. Фильтрат имеет рН7, 1403 единицы Р-амилазы íà 1 мл и 28,0 единиц а-1,6-глюкозидазы на 1 мл. Смесь перемешивают для адсорбирования двух энэимов.
Затем смесь отфильтровывают для регенерации энзимов и испытывают уа активность. Полученные результаты представлены в табл. 5.
Затем смесь крахмала и целита, на котором были адсорбированы оба энзнма, добавили к 10 o ному водному раствору декстрина, содержащему
10% хлористого натрия. Это делают, чтобы осуществить элюирование энзимов с адсорбентов. В результате Р-амилазу и а-1,6-глюкозидазу регенерировали с выходами 100 и 85% соответственно.
Пример 13. Фильтрат (каждый объемом
100 мл) культуры микоидов разновидности Bacillus cereus, содержа»цей 758 единиц Р-амилазы и
37,1 единицы а-1,6-глюкозидазы на 1 мл, смешивают с 5 г каждого из следующих веществ: кислой глины, бентонита, талька, целита и перлита с целью адсорбции а-1,6-глюкозидазы.
Адсорбированный энзим регенерируют фильтрацией или центрифугированием, пцательно промывают водой и затем определяют его активность
Полученные результаты представлены в таблице ».
Как видно из приведенных данных, а-1,6-глюкозидаза удовлетворительно адсорбируется всеми адсорбентами, количество адсорбированного энзима 400 — 700 единиц на 1 г.
Пример 14. К 100 г (вес сухого вещества) сжиженного крахмала с декстрозиым эквивалентом 1,5% добавляют 30000 единиц Р-амилазы, 3000 единицы а-1,6-глюкозидазы и
0,73 CaCI2. Смесь разбавляют до общего объема
nnnanva %r»A мп яягтмяяют nn % Г я нгтянлйпйо
611596
1г вают рН в интервале 6 — б 5. В этих условиях осуществляют реакцию. Через 100 час в реакционной смеси определяют состав сахара методом буТаблица 1
Количество добавляемого сульфата марганца, моль
699
11,3
6,7
678
14,2
10-7
6,5
166
18,6
1х10 6
5,8
155
23,4
5,6
132
25,0
5,9
152
28,3
10-4
5,9
153
25,2
10-3
Таблица 2
Оптическая плотность полученного мицелия (600 нм) О
6,7
377,6
130
М
10-4
6,5
236,8
12,5
Х1р-4 б,б
22,5
4 +
1 ð-4
5,9
28,8
25,0
М
Добавлено к концу 24 — го часа культивирования.
4f W
Добавлено в начале культивирования.
1Х10 6
1х10
Количество добавляемого сульфата марганца, моль
Время культивирования, час
Оптическая плотность полученного мицелия (660 нм) мажной хроматографии. Сахар содержал (%) 90,6 мальтозы, 7,1 мальтотриозы, 0,0 глюкозы и 2,3 других сахаридов.
611596
0,5
20,7
4,9
10350
l,0
10800
4,8
17,1
0,25
18,4
11190
4,7
0,5
10630
16,2
4,9
5880
13,0
4,9
4,0
106,0
24700
Показатель
121000
1860
111000
95300
6220
95,1
86,7
Нитрат натрия
Цитрат натрия
Тартрат натрия
Тартрат натрия
Контрольный (без добавок) Количество рапсового жмыха, % от среды
Контрольный. (без добавок) Первоначальная активность (А) Остаточная активность (В) Активность фиксированного энзима (С) Выход фиксированного энзима (С/А-Вх100), %
Оптическая плотность полученного мнцелня
Таблица 3
Таблица 4
Таблица 5
611596
Таблица 6
Båùåñòâî
Кислая глина
612
700
Бентонит
648
694
416
Тальк
Целит
Перлит
492
532
Составитель М. Андреева
Техред E. Давидович Корректор С. Шекмар
Редактор E. Корина
Тираж 568 Подписное
П11ИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР
"по делам изобретений и открьггнй
113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб„д. 4/5
Заказ 2943/49
Филиал ПЛП "Патент". r. Ужгород, ул. Проектная, 4
Формула изобретения
Способ получения фермента а-1,6-глюкозидазы путем культивирования микроорганизма рода Bacillus на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью получения одновременно с указанным ферментом фермента
Р-амилазы, из микроорганизмов Bacillus используют штаммы; Baci l l us cereus ar.
mycosides (FERM N 2391) или Bacillus sp. УТ 1002
{FERM Р 2837) или Bacillus sp. УТ 1003 (FERM
Р 2838).
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:
1. Патент Великобритании У 1281093, кл. С 3 Н, 1972.
