Штамм 123, несущий ост , сам , ан плазмиды, используемый при биологической очистке воды от нефти и нефтепродуктов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ пц 6I2958

Союз Советских

Со,.иалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (51) Ч. Кл. С 12К 1/02

С 02В 9/02 (22) Заявлено 01.12.76 (21) 2425251/28-13 с присоединением заявки Ne

ГосУдарственный комитет (23) П ио итег

Совета Министров СССР ло делам изобретений (43) ОпУбликовано 30.06.78. Бюллетень М 24 (53) УДК 663.11.576.8 (088.8) и открытий (45) Дата опубликования описания 29.06.78 (72) Авторы изооpстспия

А. М. Боронин, А. Л. Пориц и Г. К. Скрябин

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (71) Заявитель (54) ШТАММ PSEUDOMONAS AERUGINOSA 123, НЕСУЩИЙ

ОСТ+, САМ+, NAH+ ПЛАЗМИДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ

ПРИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЧИСТКЕ ВОДЫ ОТ НЕФТИ

И НЕФТЕПРОДУКТОВ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения мультиплазмидного штамма, используемого для очистки окружающей среды, в частности для резорбции пленки нефти и нефтепродуктов в воде.

Известен штамм Pseudomonas aeruginosa

РАО, содержащий плазмиды САМ, ОСТ, NAH, SAL, контролирующие утилизацию углеводородов, используемый для микробиологической деградации нефти и нефтепродуктов (1).

Недостатком известного мультиплазмидного штамма P. aeruginosa PAO является низкая скорость утилизации Heочищепной нефти.

Исходным штаммом для получения предлагаемого является штамм P. aeruginosa 121, способный утилизировать октан. Этот штамм использован в качестве реципиента для внесения в него методом коньюгационного переноса плазмид биодеградации (2).

Недостатком этого штамма является также невысокая скорость утилизации нефтепродуктов.

Целью изобретения является получение штамма, способного с высокой скоростью осуществлять деградацию нефти, мазута и смазочных масел, который может быть использован для очистки окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Мультиплазмидный штамм P. aeruginosa

123 получен путем коньюгационного переноса

5 в исходный штамм плазмид. Перенос САМ плазмиды в исходный штамм был осуществлен из штамма P. putida С.19. Полученный эксконьюгант обладает способностью утилизировать октан и камфору в качестве единст10 венных источников углерода. Затем в исходный штамм, растущий на октане и камфоре, был внесен также NAH плазмид из штамма

P. putida 51, после чего он приобретает способность деградировать октан, камфору, наф15 талин и салицилат.

В табл. приведена частота переноса САМ и

NAH плазмид.

На фиг. 1 приведены кривые роста штам20 мов P. aeruginosa 121 н 123 на неочищенной нефти.

При выращивании штамма P. aeruginosa

123 на минеральной среде, содержащей нафталин, камфору, октан, салицилат в концен25 трации 4 мм, наблюдается увеличение скорости роста (кривая а) по сравнению с ростом на среде, где в качестве источника углерод612958

Таблица lac ahura

СеленРециинент

Донор переноса (ио донору) ция

10 — 3

Р. aerugiuosa 121 ОСТ+

P. aerugiuosa 122, ОСТ+ СЛМ

Рр С. 19 СЛМе met

Р, putida 51 1чЛН adc

СЛ. 11 ного питания присутствует только один из перечисленных углеводородов (кривая б) .

Штамм Р. aeruginosa 123 хранится в коллекции Музея лаборатории внехромосомной наследственности ИЬФМ АН СССР и имеет следующую характеристику.

Морфологические культуральные признаки.

Клетки прямые, палочковидные, размеры (2 — 5);,((0,5 — 0,7) мк. Подвижные монотрихи, грамотрицательные, неспороносные.

Мясо-пептонный агар.

Колонии гладкие бесцветные, край неровный, в среде накапливается пигмент зеленого цвета.

Мясо-пептонный бульон.

Образуется муть, хлопьевидный осадок и флуоресцирующий пигмент.

На стандартных средах, перечисленных выше, образуется пигмент циоцианин.

Картофель. Отмечается хороший рост с образованием слизи.

Физиологические признаки. Лэроб. Растет при температуре 30 — 42"С, при 4 С вЂ” не растет.

Отношение к сахарам. Использует d-глюкозу, d-фруктозу, d-рибозу, глюконат. Не усваивает трегалозу.

Отношение к углеводородам, Использует нафталин, н-алканы, камфору.

Отношение к источникам питания. Ассимилирует аммонийный и нитратный азот.

ii р и м е р. Штамм Р. aeruginosa 123 выращивают па минеральной среде следующего состава, г:

К2НРО 10

КН Р04 1

Ь1 -14N0s 2

МЦ$04 7Н О 0,05

FeS04 7Hs0 0,01

CuS04. 7Н О, мг 2

НаЫОа Н О, мг 0,06

MnS04. Н О мг 0,3

И аМо04 2Hs0, мг 3

Лп$04 Н О 20

СаС1 6Н О 10

tbiCls 6Н О 0,5

Н О, л 1

В 250 мл колбы вносят 50 мл минеральной среды, 2,5 мл источника углеродного питания (нефть, мазут и смазочное масло) и 5+10 клеток (до конечной концентрации 10" ). Куль15 0

05 тивирование производят на качалке при 30 С.

Ежесуточно берут пробы, количество жизнеспособных клеток определяют высевом разведений на среду М11.ч.. Подсчет колонии осуществляют через 24 часа.

Кривые роста штаммов Р, aeruginosa 121 и 123 на неочищенной нефти демонстрируют разницу в способности деградировать неочищенную нефть у экспериментально полученного штамма и исходного, выражающуюся в скорости роста (см. фиг. l).

Кривая а показывает изменение плотности клеток (количество клеток в мл среды штамма) штамма P. aeruginosa 121 во времени при концентрации нефти в 5-ной среде. Кривая б показывает существенное увеличение скорости роста штамма Р. aeruginosa 123 при наличии САМ, Г АН и ОСТ признаков, контролирующих деградацию алканои, бициклических, полициклоароматических, ароматических углеводородов нефти. Максимальную плотность клеток 5 10 штамм P. aeruginosa

123 достигает на нефти на третьи сутки, исходный штамм плотность 3 10 клеток/мм достигает на пятые сутки, На фиг. 2 представлены ростовые характеристики двух штаммов Р. aeruginosa 121 и

123, утилизирующих мазут, как единственный источник углеродного питания.

Максимальная плотность клеток штамма

Р. aeruginosa 121 на мазуте 5 10 — 10" клеток/мл (кривая a). Кривая б показывает увеличение скорости роста штамма Р. aeruginosa

123 на мазуте и степени его деградации за счет включенных в клетку плазмид биодеградации. Минимальная rIJIOTHocTb клеток llITaivlма Р. aeruginosa 123 на мазуте 10" клеток/мл.

3а двое суток экспериментально полученный штам 1 . aeruginosa 123 осуществляет резорбцию нефтяной пленки, утилизируя составные части нефти и мазута.

При сравнении предлагаемого мультиплазмидного штамма с известными видно, что скорость роста штамма Р. aeruginosa 123 на неочищенной нефти и мазуте значительно превышает скорость роста штамма аналога

Р. aeruginosa AO, так как штамм P. aeruginosa PA0 нарастает до максимальной плотности за 5 — 6 суток, а сконструированный нами штамм P. aeruginosa 123 — за 2 — 3 суток.

Таким образом, характерной особенностью мультиплазмидного штамма Р. aeruginosa 123, 612958 сконструированного путем коньюгационного переноса плазмид биодеградации, является способность утилизировать алканы, ароматические, циклические и полициклические органические соединения, а также способность деградировать нефть и нефтепродукты с высокой скоростью.

Формула изобретения

Штамм Pseudomonas aeruginosa 123, несущий ОСТ+, СЛМ+, NAH+ плазмиды, используемый при биологической очистке воды от нефти и нефтепродуктов. Хранится в коллекции музея лаборатории внехромосомной наследственности ИБФМ ЛН СССР.

Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, размеры (2 — 5) )((0,5 — 0,7) мк.

Подвижные монотрихи, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Мясо-пептонный агар. Колонии гладкие, бесцветные, край неровный, в среде накапливается пигмент зеленого цвета.

Мясо-пептонный бульон. Образуется муть, хлопьевидный осадок и флуоресцирующпй пигмент.

Картофель. Отмечается хороший рост с об. разованием слизи.

Физиологические признаки.

Отношение к углеводам. Усваивает d-глюкозу, d-фруктозу, d-рибозу, глюконат. Не усваивает трегалозу.

5 Отношение к углеводородам. Использует нафталин, н-алканы, камфору.

Отношение к источникам питания. Ассимилирует аммонийный и нитратный азот.

5Келатину разжижает.

10 Молоко свертывает.

Растет при температуре 30 — 42 С.

Аэроб. Рост не наблюдается при 4 С.

Предлагаемьш штамм в отличие от извест15 ного позволяет за двое суток осуществлять резорбцию нефтяной пленки, утилизируя составные части нефти и мазута.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент СШЛ Ne 3813316, кл. 195 — 28, опублик. 1974.

25 2. Штамм Pseudomonas aeruginosa 121.

Хранится в коллекции музея лаборатории внехромосомной наследственности ИБФМ АН

СССР, 1976.

612958

Время (дни) Риг,1

yg

Р ОВ

1Ð7

B о 1Ц6

2 1

Время (oeu) Фиг.2

Подписное

Заказ 1258/16 Изд. № 520 Тираж 568

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Составитель М. Ларина

Редактор T. Горячева Техред И. Рыбкина Корректор Л. Денискина