Способ получения дезоксирибонуклеиновой кислоты

 

ОПИС

ИЗОБРЕТЕНИЯ 1>652187

Ссноз Соеетсннк

Сецнаннстнчесннк

Республнн

К АВтОГСКОМ СВИДКтГЛЬСтВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено2307.75 (21) 2159866/23-04 (53) М. Кл.

С 07 Н 21/04 с присоединением заявки ¹â€”

ГосударстаЕнный комитет

СССР но делам изобретений н открытий (23) Приоритет

Опубликовано 150379 Бюллетень № 10

Дата опубликования описания 150379 (53) УДК 547.963. . 32.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

Г.Д.Бердышев, Ю.Д.Бабенюк и Н.A.Ëóöåíêo

Киевский ордена Ленина Государственный универститет им. Т.Г.Шевченко (7!) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНОЙ

ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения дезоксирибонуклеиновой кислоты иэ биологических истбчников - гонад рыб, добываемых во время промышленного лова.

В настоящее время нуклеиновые кислоты используются в научных целях для изучения структуры и функции

10 нуклеиновых кислот, а также применяются для изучения их мутагенного действия на генетический аппарат клетки.

Кроме того, нуклеиновые кислоты широко применяются в качестве препаратов в медицине. как лечебные средства при лучевой болезни, раковых заболеваниях, атеросклерозе и т.п., используются для получения и синтеза азотистых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов.

Следует отметить, что препараты высокополимерных нуклеиновых кислот, до настоящего времени получают только иэ природного биологического сырья. Химический и ферментативный синтез полимерных нуклеиновых кислот только изучается и не нашел еще широкого применения.

Сырьем для выделения нуклеиновых кислот в лабораторных условиях являются всевозможные органы и ткани как животных, так и растительных организмов, в том числе и микроорганизмов. Однако содержание нуклеиновых кислот в них неодинакова.

Поскольку выделение нуклеиновых кислот весьма сложный, трудоемкий и дорогостоящий процесс, для промышленных целей необходимы источники сырья, характеризующиеся большим содержанием нуклеиновых кислот.

В настоящее время для промьдаленного получения препаратов в дезоксири-, бонуклеиновой кислоты (ДНК) используют, в основном, зрелые молоки рыб, поскольку они содержат наибольшее количество ДНК по сравнению с друг:пи источниками. Например, высушенные молоки лососевых Рь1б со держат 49% ДНК.

Молоки различных видов пресноводных и морских рыб являются наиболее удобным и подходящим сырьем дЛЯ промышленного получения ДНК еще и потому, что-они содержат весьма незначительное количество рибонуклеиновых кислот (РНК) и других примесей.

652187

3, Для получения больших количеств

ДНК обычно заготавливают молоки высокополовозрелых рыб, добываемых на рыборазвОдных заводах, на местах нерестилнц; или специально снаряженной научной заготовительной экспедицией. Собранные молоки или немедленно используют для выделения из них препаратов ДНК или подвергают глубокому замораживанию в специальных холодильниках до -20, - 70 С с послеа дуюцим хранением в диапазоне тем- l0 ператур от 0 до -25 С. Недостаточно глубокое охлаждение может привести к повреждению ДНК имеюцимися в молоках ферментами-нуклеазами.

Согласно известному способу дез15 оксирибонуклеиновую кислоту получают из спермы рыб путем ее гомогенизации, солевой экстракции деэоксирибонуклеопротеида, диссоциации его на ДНК и белок и поСледуюШей детергентной депРотейизации. напРимер, берут свежие зрелые молоки сельди 170 см извлекают ядра сперматозоидов путем . плаэмолиза спермы ледяной дистиллированной водой в течение 20 мнн. Затем суспензию ядер центрифугируют в течение 15 мин при 3000 -об/мйи иа холоду. Образовавшийся рыхлйй белый осадок суспензируют в 500 мл воды и центрифуГируют прй 30ОО об/мий. 30

Осадок ядер суспенэируют в 0,005%- ном растворе лймонной кислоты, снова центрифугируют. Осадок, прожтый два раза водой, высушивают" смесью спирта и эфира. Полученный осадок ядер суспензируют в 150 см воды и го-

" могенизируют в 250 мл 10%-ного раствора хлористого натрия, после чего вязкую массу разбавляют в.1100 мя ! раствора ИаСЙ . После 12-часового ,охлаждения вязкую массу ДНК смеши вают с 9 объемами воды. Образовавшийся осадок Днк в виде длинных нитей несколько раз промывают водой, спиртом и высушивают спирт-эфиром. После этого иэ );НП выделяют ДНК. Для этого. берут 40 мл деэоксирибонуклеопротами на в 1ОЬ-ном растворе NaCg переиасыцают .хлористым натрием и оставляют, на 10 дней s холодильнике дЛя отделе-, ния белка от ДНК. Затем смесь центри- 50 фугируют; осадок. белков отделяют, а полученный супернатаит (для дальнейшей очистки от белков) пропускают через слой йорошкообразной целхполозы (или через бумажный фильтр). 55

Нуклеиновые кислоты осаждают несколькими объемами 964-ного спирта. ДНК высушивают в спирт-эфире и над Р О при 100 С в вакууме (1). целью изобретения является упро- 9) шение способа получения целевого продукта и расширение сырьевсй базы.

Поставленная цель достигается тем что в качестве сырья используют гонады

111-У стадий половой зрелости рыб, консервированные в концентрированном этиловом спирте без использования минусовых температур.

Описывается способ получения дезоксирибонуклеиновой кислоты, заключающийся в том, что гонады ill-y стадий половой зрелости рыб, консервированные в концентрированном этиловом спирте, гомогеннзируют, гомогенизированную ткань обрабатывают протеолитическим ферментом, обычно трнпсином или проназой, осуществляют солевую экстракцию дезоксирибонуклеопротеида, диссоциацию его на ДНК и белок и последуюцую детергентную депротенизацию. Целевой продукт выделяют известными приемами.

Пример . Берут 200 r консервированных в этаноле гонад"рыб(Ш-У стадий половой зрелости), измельчают на гомогенизаторе в 1 л 0,15 М раствора хлористого натрия, содержащего

0,05 М раствора цитрата натрия и центриФугируют. Этот процесс промывки ведут до тех пор; пока надосадочный раствор не дает осадок при добавлении к нему 5% трихлоруксусной кислоты (3-4 раза). После этого осадок сусйензирувт в 400 мл раствора протеолитического фермента, например трййсина или проназы (50 микрограмм в мп,"20 мг s 400 мл)„ инкубируют в течение 18 ч при 37 С. Лизированные клетки обрабатывают 0,5Ъ додецилсульфата нфФрия (которйй инактивиРует протеолитический фермент и денатурирует белки дНП, частично его депротеинизируя) . Вязкую массу, содержащую ДЯП, суспензируют

s 2 л раствора, содержацего 16,16 г хлористого натрия (0,15 N) и 71,4 r цитрата натрия (0,05 М), далее добавляют 1 л раствора, содержащего

8j8 г хлористого натрия, 35,5 г цйтрата Натрий и 180 r парааминосалициловой кислоты (ПАСКа), перемешйвают и к полученной смеси приливают 3 л водонасыценного фенола, рН

8,3 (1,98 л свежеперегнанного фенола

0,79 л дистиллированной воды,.

198 мл 1 н КОН).

После встряхивания в течение 1 ч сМесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение 30 мин. К надосадочной жидкости добавляют сухой хлористый натрий до конечной концентрации 3 И (173 г на 1 л раствора),перемешивают до растворения соли н приливают равный объем смеси хлороформизоамиловый спирт (24:1), встряхивают в течение

45 мин и центрнфугируют в течение

20 мин при 2500 об/мин. Надосадочную жидкость (раствор ДНК) вливают в равный объем концентрированного этанола. Нити ДЯК выпадают в осадоку,их собирают., центрнфугированием, промы-. вают последовательно следующими.растворами: 3 М раствор хлористого натрия + этанол (2:1), этанол + эфир (3,«1) н эфир. нити ДНК подсушивают

652187

Формула изобретения

Составитель Г.Коннова

Редактор Л.Новожилова Техред М.Петко Корректор И.Ковальчук

Тираж 512 .Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

-13035, Москва, Ж-35, Рауыская йаб., д.4/5

Заказ 979/25

Филиал ППП Патент, r.Óæãoðoä, ул.Проектная,4 в течение 3-4 ч в термостате при

37 С,а затем в вакууме-эксикаторе. с CaCP@

Для получения целевого продукта (ДНК) повышенной частоты ДНК, полученную из гонад, обрабатывают ферментом РНК-азой (15 мкг/мл), предварительно. прокипяченным для разрушения примесей ДНК-азы, а затем протеолитическим ферментом трипсином (100 мкг на 1 л раствора). PHKаза удаляет примесь РНК в препара- 10 тах ДНК, а трипсин переваривает

РНК-азу и оставшиеся в ДНК примеси белков.

OT продуктов ферментативного гидролиза РНК освобождают двухкратным 15 переосаждением в изопропиловом спирте. После такой обработки ДНК несколько раз перерастворяют в стандартном солевом растворе (0,15 М NaCP,+

+ 0,015 М цитрат натрия, рН 7,0), З, проводят еще одну-две депротеинизации с хлороформом, после чего осаждают добавлением двух объемов концентрированного этанола, промывают несколько раз 7ОЪ-ным этанолом, эфиром и сохраняют s 70В-ном этаноле при О3 С или в высушенном виде в вакуумном эксикаторе над СаСЦ, или в ст@йдарт-з ном солевом растворе в зависимости от дальнейшего исйользования.

Нище йриведейы данные о свойствах и характеристиках препаратов ДНК, полученных ойисанным методом из консервированных в этаноле гонад рыб, например горбуши, хранящихся в 96%ном этаноле в течение 1 ч. 35

Молекулярный вес, млн . дальтонов 8-10

Гиперхромиый эффект,З 37-40

Содержание беЛка,Ъ Около 1 40

Примеси полисахаридов Нет

Примеси PHK Нет

Примеси денатурированной ДНК Нет

Пример деградированных продуктов ДНК, PHK . Нет

ЕЪьо nSo 2,8 а

1,92

li3 е/р/ 6600

Фосфор 1,7

Температура плавления С 86 8

Содержание фенола Нет

Аналогична характеристика репаратов ДНК, полученных из гонад карпа, камбалы и некоторых других рыб, законсервированных в этаноле.

1. Способ получения дезоксирибонуклеиновой кислоты из спермы рыб путем ее гомогенизации, солевой экстракции дезоксирибонуклеопротеида, диссоциаций его На ДНК и белок и по "след чОщей детйргентнОй депротенм зации, отличающийся тем, что, с целью унрощения процесса н расширения сырьевой базы, в качестве сырья используют гонады 111-У стааий половой зрелости рыб, консерзироеаиные в концентрированном этиловом спкрте, а гомогенизированную ткань см5уабатывают,прОтеолитическим ферментом.

2. Способ flP П.l о т л и ч а ю," шийся тем, что s качестве протеолитических ферментов используют трипсин или проказу.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1 Ее 1" К.УЫ)®" „,Kl „ A> f8oht K. "8+clooрР01 с1 A71A ", Hopp& $иВЮРЬз всйР. эЬ ЗЕОЙ. СИФшЕВ.

1951, В 289, 224-2 34