Спин-меченые производные олигорибонуклеотидов как спиновые зонды для исследования механизма действия ферментов и способ их получения
ОПИСАНИЕ:
ИЗОБРЕТЕНИЯ
Сееоэ Советскмк
Сои(мапмстмческн и
Респубянк
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (64) дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 310577 (21)2491239/23-04 с присоединением заявки %— (23) Приоритет— (Ы) М. Кл. (07 Н 2 1/02
А 61 К 29/00
Государственный комитет (С (Р н о делам ивоб ретени и . н открытий (53) УIlK547.963.3. .541.69(088.8}
Опубликовано 300479. Бюллетень ¹ 16
Дата опубликования описания 300479 (72) Авторы
ИЗОбрЕтЕНИя C.N.æåíoäàðîâà, B.A.Ïîðîòèêoâà, В.П.Клягина и P.H.æäàíoâ
Институт биологической физики AH СССР и Научно-исследовательский институт по биологическим испытаниям химических соединений (71) Заявители (54} СПИН-МЕЧЕНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ОЛИГОРИБОНУКЛЕОТИДОВ
КАК СНИНОВЫЕ ЗОНДЫ gJIH ИССЛЕДОВАЛИ Я МЕХАНИ 3 МА ДЕЙСТВИ Я
ФЕРМЕНТОВ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
Данное изобретение относится к новому способу получения новых спинмеченйх производных олигорибонуклеотидов общей формулы NpN, NpN u NpNpN где Np u N — нуклеотиды и нуклеозиды пиримидинового и пуринового ряда, Np u N — производные аденозин-3-фос-. фата или цитидин-3-фосфата и соответственно цитидина, содержащие спиновую метку в виде остатка 1-оксил-2,2,5,510 тетраметил-3-карбонилпирролина в качеСтве заместителя по амино-группе аденина или цитозина, являющихся спиновыми зондами для исследования механизма действия ферментов, катализирующих различные превращения рибонуклеиновых кислот, и определения их содержания в организме.
Известны спин-меченые монорибонуклеотиды, которые применяются в качестве спиновых зондов для изучения
Na, К-аденоэиитрифосфатаэы llj .Известные спин-меченые рибонуклеотиды являются либо моно-, либо полирибонуклеотидами.и являются спиновыми зондами для определенных ферментов.
Цель изобретения — синтез новых спин-меченых производных олигорибонуклеотидов, расщиряюших арсенал ® средств исследования механизма действия ферментов.
Известен способ получения спкнмеченых монорибонуклеотилов, в частности спин-меченых аденозинтрифосфатов, по 2 (3 )-гидроксильной группе действием имидазолида кислоты-радикала на водные растворы нуклеотидов (2). Однако этим методом трудно получить спин-меченые олигорибонуклеотиды из-за неустойчивости ими- дазолида кислоты-радикала.
Поставленная цель достигается путем использования в качестве спин(.меченых производных нуклеоэид-2, 3-циклофосфатов и проведения реакции при участии соответствующих ферментов.
Настоящий способ получения спинмеченых производных олигорибонуклеотидов заключается в том, что спинф Г меченые нуклеозид-2,3 -циклофосфаты или нуклеозиды пиримидинового и пуринового ряда подвергают взаимодействию соответственно с нуклеозидами или нуклеотидами при температуре 0-4 С в присутствии специфических рибонуклеаз в соответствующем буферном растворе с последующим вэа- ° имодействием при температуре 36-37
659573
55 полученных спин-меченых динуклеозидмонофосфатов с нуклеозид-5-дифосфатами при участии полинуклеотидфосфорилазы в трис-буфере при РН 9,0-9,2.
Получение исходных веществ.
Пример 1. N -(1-оксил-2,2,5,5б
-тетраметил-3-карбонилпирролин) — 5 ! I
-аденозин-2 (3 )-фосфат.
К суспензии 0,2 г (0,47 М) Ру-соли аденозин-2 (3 )-фосфата в 3 мл абсолютного пиридина добавляют хлорангидрид, полученный из 1,1 г 2,2,5,5-тет- (p раметил-З-карбоксипирролин-1-оксила, в 2,5 мл абсолютного пиридина при охлаждении в бане из сухого льда и . ацетона. Образовавшийся раствор оставляют при комнатной температуре )5 на 3,5 ч. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают абсолютным пиридином. К охлажденному фильтрату добавляют 3,5 мл дистиллированной воды и
pacTsop зкстрагируют три Раза хлоро" формом (20, 10, 5 мл). Хлороформный слой сушат безводным Na Смолу отфильтровывают и промывают тремя объемами 2 М водного пиридина. .Фильтрат и каждую из промывок пропускают через колонку с 40 мл свеже- го Дауэкс 50х4 (100-200 мещ) в Ру+форме. Объединенные промывки упари- 35 вают при добавлении пиридина до выпадения осадка кислоты. Из этой смеси (рН 6-7) кислоту-радикал экстрагируют эфиром (100 мл) . Водный раствор упаривают на роторе при комнат- 40 ной температуре досуха. Получают 0,19 г спин-,меченого производного, загрязненного исходным нуклеотидом. Далее очистку проводят методом препаративной БХ в системе (А). Выход 60Ъ| R 0 61 (A) Потн 0,86; УфектрsЛмакс282 нм. О™ Пример 2. N -(1-оксил4 -2,2,5,5-тетраметил-З-карбонилпирролин)-цитидин-2 (3 )-фосфат полу- 50 чают аналогично описанному в приме-. ре 1. Время гидролизь перацильного производного 30 мин. Выход 70%; R 0,69 (А); Uov0,87; Уф-спектр: Л, 260, 303 нм.™ Пример 3. N4-(1-оксил2,2 5,5-тетраметил-З-карбонилпирролин)-цитидин получают аналогично описанному в примере 1. Очистку проводят методом препаративной ТСХ на пластинках из силуфола в системе н-бутанол, насыщенный водой. С адсор" бента спин-меченый цитидин элюируют этанолом. Выход 60%; Rg 0,84 (Б) 1 цотн1,12. Т.пл. 132-134 . УФ-спектр: Л 260, 303 нм. Спектр ЭПР (хлороформ): <" 15, б; содержание спи нов: 5, 8 10 спин/моль. Для С з Н2 N40> 23 вычислено, Ъ! С 52,80; Н 6,16;N 13,68. Найдено, Ъ: С 53,19; 52,97; Н 6,45; 6,35; М 13,93; 13,81. П р и м е Р 4. N"-(1-оксил2,2,5,5-тетраметил-Ç-карбонилпирролин)-цитидин-2,3-циклофосфат.153 о.е. / / (8 мкМ) спин-меченого цитидин-2 (3)— фосфата растворяют в 1 мл воды, доводят РН раствора О, 1 H. НСР, до б, О и добавляют 25 мг п-толуолсульфоната циклогексил- P-(N-(N-метилморфолиний)l— -этилкарбодиамида. Реакционную смесь оставляют на 4 ч при комнатной температуре, поддерживая РН равным примерно 6,0. Затем реакционную смесь упаривают досуха на роторе. Остаток промывают несколько раз эфиром, после чего растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и делят методом препаративного электрофореза на бумаге. После обессоливания в системе этанол..вода-7;3 получают 85 о.е.(56%) хроматографически чистого циклофосфата R< 1 A); ()отн О 6: УФ-спектр: Л„„,з, 260 ЗО 3 нм ° Пример 5. N — (1-оксил-2,2,5,56 -тетраметил-3-карбонилпирролин) -аденозин-2,3-циклофосфат получают аналогично описанному в примере 4. Выход 52%; R< 0,85 (A); U т„ 0,64; УФ-спектр: Л „ 282 нм. Получение целевого продукта. Пример б. N -(1-оксил-2,2,5,54 -тетраметил-3-карбонилпирролин) -цити/ f дилил-(3 5 ) -цитидин. 136 о.е. I. f (8 мкМ) спин-меченого цитидин-2,3-циклофосфата и 80 мкМ цитидина в 0,16 мл 005 М трис-НС8 -буфера (РН 76), содержащего панкреатическую рибонуклеазу в концентрации 0,16 мкфмл, инкубируют при 0-40 С около двух неI ( дель. Спин-меченый цитидилил-(3-е-5 )-цитидин выделяют методом препаративного электрофореза на бумаге. Дополнительную очистку проводят, хроматографируя в системе (Б) . Получают 23 о.е. (ЗОЪ) ° R с О ° 84 (A); U 1 ° 58; УФ-спектр:Л,,с,„с262; 30 3 нм. ! Пример 7. Руанилил-(3 5 ) -N - (l-оксил-2,2,5, 5-тетраметил-3-карбонилпирролин)-цитидин. 60 мкМ гуанозин-2,3 -циклофосфата (гуаниг диниевая соль) и 180 мкМ спин-меченого цитидина в 6 мл 0,01 М фосфатного буфера {рН 7,0), содержащего рибонуклеазу Т в концентрации 50 ед.акт/мл, инкубируют в течение 5-6 ч при 00С. Затем реакционную смесь делят методом препаративного электрофореэа на бумаге. Полосы,,со; держащие спин-меченый гуанилил-(5).— -цитидин, прищивают к новым листам бумаги и хроматографируют в системе .В. Получают 153 о.е. (5 мкМ). Выход 20%; R< 0,7 (S); U „1,5; . УФ-спектр:Л, „259, 302 нм. 6595 Составитедь Л. Никулина Редактор В. Минасбекова Техред И . Асталош Корректор Н.Стец Заказ 2114/4 Тираж 512 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, 3%-35, Раушская наб., д.4/5 Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул. Проектная, 4 / ,4 Пример 8. Гуанилил-(3 5 )— -N-(1-оксил-2,2,5,5- тетраметил-3карбонилпирролин, -цитидил-(3 5 )-уридин. 145 о.е. (5 мкМ) GpC 2,5 мкМ уридин-5 -дифосфата (динатриевая соль) и 3 мг ПНФ-азы М. Iysodeiticus растворяют в 0,5 мл 5 0,05 M трис-НС8-буфера (рН 9,0-9,2), содержащего 0,01 M MgClg и 0,05 мМ ЭДТА, и инкубируют при 36-37О С. Через 2 ч всю реакционную смесь наносят на бумагу и хроматографируют в (0 системе Б. Полосы, соответствующие различным компонентам реакционной смеси, элюируют водой и дополнительно очищают с помощью электрофореза и хроматографии в системе.A. Получают 10 о. е. (15%) GpCp U (Rp (Up) 1, 55 (А); ()отн О, 65; УФ-спектр: и макс 259, 307 нм)™и 5 о.е. GpCp™UpU ()р) 1 02 (A) l U „0 68; уф-спектр: й„„,,а„ 259, 307 HM) Хроматографию и электрофорез проводят на бумаге марки ленинградская M и. FN-3. При хроматографии ис-. пользуют следующие системы растворителей: этанол — 1 М ацетат аммония (PH 7,5), 7:3 (A); этанол — концентрированный аммиак — вода-65:10:25 (Б); изопропанол-. концентрированный аммиак — вода-7:2:1 (8). Электрофорез на бумаге проводят в приборе для вертикального электрофореза фир- 30 мы Labor (Венгрия) в течение 2 ч с градиентом напряжения 20 В/см в 005М триэтиламмонийбикарбонате, рЛ 7,5. Формула изобретения 1. Спин-меченые производные олиго-,35 рибонуклеотидов общей формулы NpN 73 6 0 Ф NpN u NpNpN ° где Np u N — нуклеотиды и нуклеозиды пиримидинового и I fl пуринового ряда; Np u N — производные аденозин-3-фосфата или питидин-3-фосфата и соответственно цитидина, содержащие спиновую метку в виде остатка 1-оксил-2,2,5,5-тетраметил-3-карбонилпирролина в качестве заместителя по амино-группе адеыина или цитозина,как спиновые зонды для исследования механизма действия ферментов. 2. Способ получения соединений по п.1, отличающийся тем, f что спин-меченые нуклеозид-2,3-циклофосфаты или нуклеозиды пиримидинового и пуриновогб ряда подвергают взаимодействию соответственно с нуклеоэидами или нуклеотидами при температуре 0-4 С в присутствии специфических рибонуклеаз в соответствующем буферном растворе с последующим взаимодействием при температуре 36-37 С полученных спин-меченых динуклеозидмонофосфатов с нуклеозид-5-дифосфатами при участии полинуклеотидфосфорилазы в трис-буфере при рН 9,0-9,2. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Сухоруков Б.И., Петров A.È. Спин-меченые нуклеозиды, нуклеоэид-5-моно-,ди- и -трифосфаты. †Биофизика", 1975, 22 ;}, с.965. 2. Табак М., Pyyre Э.К., Смирнова И.Н., Петров A.È., Сухоруков Б.И., Твердислов В.А. Взаимодействие мембранного препарата Na, К-АТФ-азы со спин-меченым аналогом АТФ.- Биохимия, 1977, 42, 9 3, с. 476.
