Реактив для определения холестерина

 

ОП ИСАН

ИЗОЬЕЕтЕНИЯ

И Е

Союз Советсеа

Соцналмстюаоеа

Республик, -;664536.—

g ЙАтИНТУ (6l) Дополнительный к патенту(32) Заявлено 17.05.73 (2l) 1928101/28 13 (23) Приоритет (32) 17.05.72 (31) Р 22241323 (33т ФРГ г (53) М. Кл.

А 61 В 10/00

9 01 -N 33/16

Гееударетееккий кеиктет

СССР ке делам кзееретенкй а еткрмткй

Опубликовано 25.05.793юллетень pfy 19 (53) УЙК 616-003, ° 215 (088,8) Дата опубликования описания 28.05.79

Иностранцы

Вольфганг фубер, Ханс Ульрих Бергмайер, Эрих Бернт, Александр Хаген, Петер Рошлау, Гтонтер Ланг и Клаус Бокан (ФРГ) (72) Авторм изобретения

Иностранная фирма

Бериигер Маннхайм ГМБХ" (ФРГ) (71) Заявитель (54) РЕАКТИВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА

B ЕИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

Изобретение относится к медицине и касается диагностических средств.

Известен реактив для определения холестерина в биологических жидкостях, со» держащий активное вещество и раствори-: 5 тать (1).

Однако такой реактив обладает недоста точно высокой специфичиостью.

Целью изобретения является повышение специфичности реактива. l0

Это достигается тем, что в качестве

I активного вещества реактив содержит смесь холестерин»оксидазы, катализы. и ацетилацетона, а в качестве растворителя аммо-. нийный буфер, причем компоненты взяты в тк

° следующем соотношении, вес.%:

Холестерин оксидаза 0,0001-0,006

Катала за 0,001 -О;06

Апет илацетон 0,05-0,2

Аммонийный буфер Остальное. 20

Реактив для определения холестерина состоит as холестерин-оксидазы и системы для определения количества образовавшейся перекиси водорода или для определенни количества холестерина. В первом предпочтительном варианте этот реактив состоит из холестерин-оксидазы, катала зы, ацетилацетона, метилового спирта и буфера, содержащего ионы аммония, причем указанные компоненты могут быть исполь эованы в отдельности или в смеси. В дру гом предпочтительном варианте реактив состоит иэ холестерин-оксидазы, пероксидазы. хромогена и буфера, взятых в отдельности или в смеси. В качестве хромогена предпочтительно использовать 2,2» с аминобензтиазолинсульфокислоту.

Реактив также может сос гоять из холестерйй -оксидазьт и производного гидразина, взаимодейсгвуюптзго гидразина, взаимодействующего. с кетогруппой с образованием гидразина, а также в некоторых случаях иэ буфера. В качестве цроизводного гидразина предпочтительнее использовать 2,4-динитрофенилгидразин.

Реагенты, кроме указанных обяаатель ных составных частей, дополнительно содержат обычные растверители, стабилиза664536 торы и поверхностно-активные вещества.

Все эти добавки обычно применяются в системах для обнаружения перекиси водорода соответственно холестерина.

Преимущественно в упомянутых выше комбинациях реагентов отдельные состав ные части содержатся в следующих соотношениях:

1. От 13 до 150 об. холестерин- оксидазы, а также от 2 ° 10 до 5 - 10 ком

8 мерческой каталаэы, от 9,05 до 0,2 мл; ацетилацетона и от 2 до 10 мл метилово

ro спирта добавляют в 100 мл буфера, содержащего ионы аммония (pH 5-7). 3a-тем добавляют 0,02-0,3 мл поверхност-но-активного вещества (предпочтительно гидроксйполиэтоксидодекана ). 2."От 3 до 40 об. холестерин- «ксидаэы, а также от 2 10 до 1 10 ком мерческой пероксндазы, от 50 до 200 мг

2,2 -аминобензтиазолинсульфокислоты, а также от 0,05 до 0,5 мл поверхностноактивногб вещества (предпочтительно гидр .оксиполиэтоксидекана) добавляют в 100 мл буфера (рН 6-8).

3. От 0,1 до 1 об.холестерин-оксидаэы, от 1 до 5 мл 1 М раствора 2,4 ди« нитрофенилгидраэина и, в некоторых случа ях, от 0,005 до 0,1 мл поверхностно-ак тивного вещества.

4. От 2 до 100 o6ь холестерин-юксида-; эы, а также от 0,1 до 2,0 мл поверхностно-активного вещества (преимущественно гидроксипОлиэтоксидодекана ) добавляют в

50 мл буфера (рН 5-9) преимущественнйм образом 0,5 М натрийфосфатного бу фера (рН 7,5). Холестерин-оксидаза представляет собой фермент, который каталиэирует реакцию: холесте ин-оксидаза, Холестерин + 0 . — в- а0 холестенон + Н 0 .

Реакция протекает количественно, благодаря чему возможно абсолютно специфическое и точное количественное определе» ние холестерина. 45

Реактив пригоден для определения холестерина в таких водных средах, как экстракты продуктов питания жидкости, содержащиеся в теле, в особенности сыворотки. so

Благодаря большой специфичности реактива может быть произведено определение только свободного холестерина. Однако связанный холестериН, который как известно находится в этерифицированной форме, и равным образом может быть определен после предварительного химического или ферментативного омыления. Химическое

4 омыление проводйт, например, под действием спиртового раствора гидроокиси калия, а ферментативное омыление - эстеразой, преимущественно холестерин-юстераэой, полученной иэ печени или поджелудочной железы.

Пример 1. Определение по перекиси водорода.

Гидрофосфат аммония (10 г) раствора ют в 100 мл воды и посредством прибавлейия 85%-ной фосфорной кислоты устанавливают значение рН 7;0; Затем прибавляют 10 оР. каталазы. Приготовленным

У раствором доводят смесь, содержащую

0,2 мл ацетилацетона и 10 мл метилового спирта, до 100 мл. Затем 7,5 мл полученного раствора смешивают с 0 5 мл сыворотки, соответственно с 0,5 мл стандартного раствора холестерина, содержаmего 200 мл % холестерина. Аликвотные количесгва растворов, содержащих сыворотку, а также стандартно2 раствора ™ лестерина смешивают в каждом случае с

5 об. холестерин-оксидазы и 0,02 мл

10%-ного раствора гидроксиполиэтоксидо декана и выдержйвают смеси в течение

70 мин при 37 С.

Затем фотометрически: определяют коли ество образовавшегося красителя нри

405 нм. Со стандартным раствором. холестерина строят калибровочную кривую.

Содержание холестерина в пробе, содержащей сыворотку, ойределяют при использовании стандарта в качестве величины . для сравнения. Контрольное определение, проведенное по Лиеберману и Бурхарду, дает отклонение примерно 5%.

Пример 2. Определение перекиси водорода, К 3 мл калийфосфатного буфера с рН7 (насышен кислородом j, в котором содержится 100 мг % 2,2 -амийобензтиазолинсульфоксилоты, прибавляют 0,05 мл 20%-ного раствора гидроксиполиэтоксидодекана и

0,02 мл коммерческого раствора пероксидазы, а также 0,02 мл перекиси водорода для удаления восстанавливающихся веществ. За смесью наблюдают с помощью фотометра в области 405 нм или 436 нм.

Как только реакция подходит к завершению, прибавляют 0,01 мл сыворотки (разбавленной водой в соотношении 1:15).

Спустя 10 мин прибавляют 0,15 об. холестериноксидазы и спустя еще 10 мин оп- ределяют разность экстинкций.

Точно таким же способом, ío при использовании стандартного раствора холестерина с содержанием 200 мг % строят калибровочную кривую. С помощью этой калибровочной кривой определяют содержа». ние холестерина в пробе, содержащей сы воротку..Измерение дало содержание холестерина 1 80 мг %. В контрольном изме ре«, нйи по Лиеберману и Бурхарду получено значение 185 мг %.

Пример 3. Определение холестенона.

Сыворотку (0,2 мл) разбавленную водой в соотношении 1:10, смешивают с

0,05 мл 20%-ного раствора гидроксиполиэтоксидодекана и 0,15 об. холестерин-оксидазы. По истечении 15 мин прибавляют

2.0 мл раствора, содержащего 1 М 2,4.динитрофенилгидразина в 1 Н. соляной

43 кислоте. Через 30 мин прибавляют4,0мл воды в гидразон, замеряют в фотометре в-.области 405 нм, Оценку производят по стандартной кривой, причем принимают во ае внимание значения, полученные в контрольном опыте. Измерение также можно проводить в области 546 йм после добавления щелочи.

Измерение, проведенное на типичной

ЗУ пробе, показано 60 мг % свободного холестерина и 154 мг $ общего холестерина (омыление спиртовым раствором гидроокиси калия).

Проведенное для сравнения определе- эе ние по Лиеберману и Бурхарду дало -результат 170 мг % общего холестерина.

Для омыления этерифицированного хо дестерина (определение общего холестерина в сыворотке) смешивают 1 мг сыворотки, 1 мл 20%-ного раствора гидрокои полиэтоксидодекана и 5 мл 0,5 М раствора гидроокиси калия в 90%-жом этило вом спирте. Приготовленную смесь нагре веют в течение 30 мин при 70 С. Затем @ раствор охлаждают смешивают с 10 мл

0,1 М раствора сернокислого магния и . производят ценФрифугирование. Раствор над осадком (13 мл). содержит общий холестерин в свободной форме. 49

Омыление этерифицированного хопесте« рина с использованием эстеразы печени, соответственно холестерин-экстеразы, производят посредством выдерживаниа сывоб

:ротки в течение 30 мин при температуре 37 С и при рН 6-8.

Пример 4. Сыворотку (О 2 мл) прибавляют х 2,5 мл 0,5 N натрийфосфатного буфера рН 7 5, содержащего 0,4% гидроксиполиэтоксидодекана» В подходящем спектрофотометре в области 240 нм определяют экстинкцщо (Е ) и вызывают ре акцию посредством прибавления 0,02 мл холестерин-оксидазы. Через 2 мин вновь определяют экстинкцию {E ). Концентрацию образовавшегося холестерина a„спедовательно, содержание холестерина опре деляют по разнице между. первым и вторым.

: определениями, причем принимают во внимание молярный коэффициент экстинкции дла холестерина при 240 нм.

Измерение, проведенное на типичной пробе, показало присутствие 58 мг% сво- ° бодного холестерина и 163 мг % общего холестерина (после омыления). Проведен ное для сравнения определение по Лиебер ману и Бурхарду дало результат 173мг% общего холестерина.

Предлагаемый реактив является высокоспецифичным и обеспечивает быстрое определение хопестерика, Формула изобретения

Реактив дла определения холестерина в биологических жидкостях, содержащий активное вещество и растворитель, о т личающийса тем,что,спелые повышения его специфичности, в качестве активного веп ества реактив содержит смесь, холестерин-оксидазы, катапазы и ацетилацетона, -а в качестве растворителя — аммонийный буфер, причем компоненты взяты в следующем соотношении, вес.%:

Холестерин-оксида за 0,0001-0,006

Катапаза . 0,00 1-0,06

Ацетилацетон 0,05-0,2

Аммонийный буфер Остальное

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в педиатрии, София, 1973, с. 651.

Составитель С. Малютина

Редактор Т. Фадеева Техред И. Асталош, Корректор В. Синицкая

Зказ 2826/55 Тираж 671 Подписное

11НИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений,и открытий

113035, Москва, Ж-З5, Раушская,наб„д. 4/5

Филиал ППП Патент", r. Ужгород, у . Проектная, 4