Способ выделения -амилазы
Союз Советскии
Социалистические
Республик
С 12 D13/10 . с присоединением заявки ¹â€” (23) Приоритет Гооудоротееииый котеитет СССР Опубликовано 25,05.80. Бюллетень,% lg > (53) УДК 663. .53(088.8) по делом изобретений и открытий Дата опубликования описания 19.05.80 (72) Авторы изобретения Р:P% (". А. И. Ка чепкина и Л. И. Орещенко (7l ) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛГНИЯ 4 -АМИЛАЗЫ Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промьгшленнести и может быть использовано для выделения грибной амилазы из раство1за нативной культурапьной жидкости. Известен способ выделения 4 -амипазы из культуральной жидкости МрЕг зчИоб oP3xQS предусматривающий ее обработку анионообменным гель-сорбентом, десорбшпо фермента в присутствии хлористого ic натрия с последующим выделением фермента из эпюента Щ . Однако при использовании анионообменного гель-сорбента (АГС) с сорбционной емкостью 3,05-3,09 мг экв/г, набухаемостью 8,4-11,4 мп/г в ОН-форме сорбштя сорбента из раствора составляет 6080%. используемый в качестве этпоента т 1С%-ный раствор хлористого натрия обес-20 печивает 63-83%-ную десорбшпо фермента кроме того, указанный гель-сорбент применяется для очистки фермента без его концентрирования. Нелью изобретения является повышение выхода и получение более очитпенного пр впар ата. Для достижения этой цели из анионообменных гель-сорбентов используют гельсорбент в Ст-форме, десорбцию фермента осуществляют ацетатным буфером рН 6,06,2, при этом концентрацию хлористого натрия устанавливают в пределах 0,51,0 М, а выделение фермента осутцествпяют введением хлористого кальция концентрацией 0,5-1,57 нри одновременном подкиспении полученной среды до р Н 6, 06,2 с последующим осаждением органичес» ким растворителем. Способ выделения dl -амилазы из культуральной жидкости AsperpKus огыое включает в себя следующие этапы: сорбцию фермента на гель-сорбенте АГС-1а: десорбцию фермента с гель-сорбента АГС1 а: осаждение фермента из эпюата. лиьт фипьное высушивание препарата высокоочищенной Ф -амипазы. Таблица 1 48-50 98-100 90-1 00 6683 Процесс осуществют следующим образом. . Культуральную жидкость при естественном значении рН 7,5-8,0 обрабатывают . в статических или динамических усповиях 5 . гель-сорбентом АГС-1а, синтезированном на основе поливинилового спирта, с сорбционной емкостью гель-сорбента 1,49 мь ° эквlг, набухаемостью 43,0 мп/г, в С .— форме, так как предварительные исследо- 0 вания показали, что гель-сорбент в С1фсрме проявляет высокую избирательную сорбционную способность к амипазе (см. т.абл. 1). В качестве десорбента рекомендуется 1 М раствор ацетатного буфера рН 6,0; который обеспечивает десорбцию фермента на 90-100% при 10 кратном концентрировании раствора. В целях восстановления активных групп гель-сорбента в раствор элюента одновременно вносят ионы хлора в виде натриевОй соли (1р0 М)о Это дает воэможность использовать гель-сорбент 5-7 раэ без регенерапии ere соляной кислотой, которая требует большой затраты времени для отмывки сорбента водой до значения рН 7,0. Внесение ионов хлора в раствор элюента позволяет использовать его в после40 дующем цикле сразу после промывки водопроводной и дистиллированной водой до значения рН 7,0. Промывают гельсорбент водопроводной водой 5 раз (тремя объемами) и три раза дистиллированной водой (двумя объемами). После 5-7 циклов использования про водится полная регенерация гель-сорбента щелочью (один раз 7%-ным и два раза 5% ным раствором) из расчета 3 объема щелочи на 1 объем смолы, затем от;50 48 4 мывают его водопроводной водой до рН 7,0 и обрабатывают раствором соляной кислоты (тремя объемами: один раз 7%-ным раствором и два раза 5%-ным раствором) с последующим отмыванием гель-сорбента водопроводной и дистиллированной водой до рН 7,0. Полная регенерация восстанавливает сорбпионные свойства гель-ссрбента, обеспечивая его 15-20-кратное испопьзование. Пример 1 (контроль) . Испопьзуют гель-сорбент АГС в ОН-форме с сорбпионной емкостью 3,5 мг.экв/г, набухаемостью 8,4-1 1,4 мл/г. Элюируюший раствор 10%-ный хлористый натрий. Объем культур альной жидкости LOO мл, амилолитическая активность 2,6 ед/мл: общая активность 260 остаточная активность 57. Сорбция достигает 78%. Получают 100 мл элюата с активностью 1,68 ед/мл: общая активность 168. Общий выход 64%. Десорбция 83%. Пример 2 . Проводят сорбцию амилазы из культуральной нативной жидкости в статических условиях на гельсорбенте АГС- а в С1-форме, сорбционная емкость 1,49 мг экв/г, набухаемость 43,0 мг/г. Содержание гель-сорбента 2% по сухому весу. Амилолитическая активность культуральной жидкости 13,0-16,0 ед/мл:, рН 7,5-8,0. Обработка культуральной жидкости гель-сорбентом проводится в емкости, снабженной мешалкой. длительность сорбции 1 ч. Смола отделяется от раствора фильтрованием и снова переносится в емкость для проведения десорбции фермента. В качестве элюента используется ацетатный буфер (1 М) в присутствии ионов хлора (1,0 NaCt ) рН 6,0-6,2. Количество элюента берут из расчета степени концентрирования фермента (в 3-10 раз меньше взятого на обработку раствора)., Йесорбция проводится также при перемешивании раствора в течение 45 мин. Смолу отдегиют фильтрованием и промывают водой для последующего цикла. Данные опыта сведены в табл . 2. Таблица 2 16000 . 100 -О,142 100,7 14400 90 . 7 16,0 1,0 15,0 75000 98 35 0000. 98 48000 100 5,0 1 3.0 27,0 3,0 16,0 Пример 3; Проводят сорбцию амилазы из культуральной нативной жидкости на гель-сорбенте. АГС-ta в Ск-форме в динамических условиях: сорбционная емкость 1,49 мг-экв/г, набухаемость 43,0 мл/г. Раствор культур альной жидкости (АС-20 ед/мл, рН 7,8) пропускают через колойку заполненную 40 r гель-сорбента, предварительно подготовленного к работе. Скорость пропускания раствора 1,,0 л/ч. Пропускают 2,0 л культуральной жидкости из расчета, что COE по амилазе составляет 750-1000 ед АС/г, гельсорбента. Сорбция достигает 100%. Десорбцию проводят ацетатным буфером (1 М) в присутствии ионов хлора (1,0 МйаС ), рН 6,0. Скорость десорбции 0,5 n/÷. Степень концентрирования раствора6 раз. Получено 334 мл элюата с активностью 120 ед АС/мл. Общий выход 98%. Преимущество метода сорбции амилазы 45 на гельсорбенте АГС-I а заключается в том, что данный образец анионита позво-. ляет работать в промышленных условиях с нативными растворами культуральной жидкости без предварительного диализа, 50 обеспечивает концентрирование фермента за сч ет использования меньших l,00 70,56 70560. 96 5 9,00 37,5 3411250 97 3 О, ЗЗ 131,0 43200 90 9 объемов элюента в 3-10 раз и приводит к 2- и З-кратной, очистке фермента по белку. Сорбция фермента составляет 98-100%, дессрбция 90- 1 00% Общий выход фермента после сорбции - десорбции 88- 98%. Второй этап очистки включает в себя выделение фермента из элюата путем осаждения органическими растворителями. Условия осаждения амилазы из элюатов, полученных с гель-ссрбента АГС-|а, следующие . о Элюат охлаждают до -4 С, вносят ионы кальция (СаСГ ) в концентрации 0,5% и рН раствора доводят уксусной кислотой (0,5 Н) до значений 6,0-6,2. Органические растворители - этиловый спирт или ацетон — охлаждают до (-110)(-15) С. Осаждение белка проводится о при непрерывном перемешивании раствора. Расход спирта составляет 2,5 объема на 1 объем элюата. Потери при осаждении достигают 15-20%. Общий выход высоко- очищенного препарата от исходной актив ности составляет 75%. Полученные препараты проявляют активность 10000120000 eg AC/ã йри содержании белка 60%. Расход ацетона 1,5 объема на 1 объем элюата. Получены препараты с активностью 7500-8000 ед AC/ã и с содержанием белка 56%. Выход активности 72%.. 668348 Таблица 3 Ацетон (25) 427500 41,0 324000 7900 Этиловыйй спирт (0,33) 44000 33000 75 1 2000 2,75 Составитель А. Качелкина Редактор Е. Месропова Техред М. Кузьма. Корректор С, Шекмар Заказ 2190/61 Тираж 522 Пбдпис но е БНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, ?K-35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патент", r. Ума ород, ул. Проектная, 4 е Таким образом, предлагаемый способ I ,выделения с4 -амилазы позволяет интенсифицировать процессы очистки и концентри-2о рованы ферментов, увеличить выход фермента на стадии концентрирования до 8898% и обеспечить общий выход высокоочищенного препарата на стадии осаждения из элюата по отношению исходной активности культуральной жидкости 70-75%. Формула изобретения зс Способ выделения И -амилазы из куль туральной жидкости Asperptlue or iae предусматривающий ее обработку анионообменным гель-сорбентом, десорбцию фермента в присутствии хлористого натрия с последующим выделением фермента из элюата, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и получения более очищенного препарата, из анионообменных гель-сорбентов используют гель-сорбент в С8-форме, десорбцию фермента осуществляют ацетатным буфером рН 6,0-6,2, при этом концентрацию хлористого натрия устанавливают в пре делах 0,5-1,0 М, а выделение фермента осуществляют введением хлористого кальция концентрацией 0,5-1,5% при одновременном подкислении полученной среды до рН 6,0-6,2 с последующим осаждением органическим растворителем. Источники информации, . принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР ¹ 319615, кл. С 08 Г 216/06, 1969.