Способ получения концентрата протеинов из семян масличных культур

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советскнк

Соцналнстнческнх

Реслублнк

1 (6() Дополнительный к патенту (22) Заявлено 200276 (21) 2324506/28-13 (51) М. Кл.

A 233 1/14 (23) Г1риоритЕт — (32) 21. 02. 75 (31) 2 0 5 04-А/7 5 (33) Италия

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий

Опубликовано 050779. Бюллетень ¹25

Дата опубликования описания 05 07, 79 (53) УДК бб8.391.4 (088.8) Иностранцы

Джанкарло Содини, Марко Канелла (Италия) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма Снампрогетти С. и. A (Италия) (71) Заявитель

I (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА ПРОТЕИНОВ

ИЗ СЕМЯН МАСЛИЧНЫХ КУЛЬТУР

30

Изобретение касается переработки растительного сырья для) получения концентрата протеинов, содержащего непригодные для употребления в пищу элементы и хромогенные соединения.

Известно, что в растениях широко распространены фенольные и полифеиольные .соединения, которые находятся в свободном виде или связаны с протеиновыми или сахариновыми составляющими, присутствующие в различных частях растений, но главным образом в семенах,. листьях, стеблях и корнях. Эти природные вещества имеют свойство окисляться до хинонов, которые, в свою очередь, быстро полимеризуются в щелочной среде и вступают в реакцию с протеинами, образуя ковалентные или водородоподобные связи.

Использование протеинов, извлеченных из растений для использования их в пищу человеком, затрудняется из-эа наличия в них фенольных компонентов, некоторые из которых являются очень токсичными, например госсипол.

Другими соединениями, присутствие которых также считается нежелательным в измельченной растительной массе, являются олигосахариды ферментного проискождения (раффиноэа, стихиоэа и т.д.), вызывающие образование газов в кишечнике, что также приводит к ограниченному применению измельченной растительной массы и протеинов в продуктах питания.

Известен способ получения концентрата протеинов иэ семян масличных культур, включающий измельчение исходного сырья, экстракцию из него проте

10 ннов раствором .гидроокиси натрия, отделение экстракта от нерастворимого остатка, осаждение протеинов из раствора экстракта минеральной кислотой, с последующим его отделением, нейтра15 лиэацией и сушкой (1).

Недостатком известного способа яв ляется недостаточно высокая питательная ценность получаемого концентрата протеина из растительного сырья.

20 Целью изобретения является получение концентрата протеина, обладающего ценными биологическими свойствами, фактически свободного от нежелательных соединений.

Поставленная цель достигается тем, что перед экстракцией протеинов исходное сырье обрабатывают смесью и-бутилового спирта и соляной кислоты в соотношении 1:5-1!240 при 20-40 С.

673144 4 чение 30 мин при 30 С при перемешиваДии.

Суспензию Центрифугируют при ско10

55 бО

-65

Способ предусматривает использование в качестве измельченной растительной массы — измельченную массу семян подсолнечника, соевых бобов и семян хлоп

Ка, полярного растворителя — спирта, кетона или сложного эфира водного раствора электролита, выбранного иэ органических или неорганических кислот или их кислых солей.

Способ заключается в следующем.

Приготовление растительных иэмель. ченных масс.

Измельченные массы из которых осуществляют экстракцию фенолов и олигосахаридов, готовят следующим образом: семена подсолнечника, семена хлопка и соевые бобы, полностью очищенные от шелухи, размалйвают при температуре +4" в гомогенизаторе типа OMNIMIXEP, изготовленном фирмой Яогча11, в присутствии п-гексана, при соотношении между количеством семян и растворителем, равном от 1 до 2. Затем измельченную массу обезжиривают п-гек саном при соотношении между объемом и весом от 1 до 10 при перемешивании в течение 1б часов при температуре

25 С. Раствор отгоняют путем фильтрации в вакууме с помощью лабораторного водоструйного насоса на Фарфоре.

При этом берут воронку Бюхнера (Buchner), используя фильтровальную бумагу Ватмана., (Nattman) 9 4. Измельченные массы высушивают в потоке азота

1 час при 25 C и измельчают в устройстве Булера (BuhIer) до помола М 2.

Химический состав сухого продукта определялся стандартными способами на содержание влаги, протеинов, липидов и сырого волокна: концентрации фенолов и олигосахаридов в измельченной массе семян подсолнечника и соевых бобов определяли в соответствии с газохроматографическими методами.

Извлечение хлорогеновой кислоты из подсолнечного масла.

Готовят раствор для экстракции хлорогеновой кислоты из подсолнечного масла следующим образом.

1 л и-бутилового спирта смешивают с 1 л водного раствора соляной кислоты, 0,5 10 N с рН, равным 2,48, раствор время от времени перемешивают, после чего выдерживают s течение ночи в делительной воронке. Верхняя фаза, . которую собирают, после того как удаляют водную кислую фазу, является рас творителем, который используют для осуществления рассматриваемых способов экстракции.

Измельчелную массу семян подсолнеч ника, приготовленную по способу, описанному выше, просеивают, используя просеивающее устройство Fr1tsch AnaIysette 3, до получения размера измельченных частиц порядка 0,050 мм, . и смешивают с растворителем при отношении веса к объему, равном 1/30 в те рости 5000 об/мин, на центрифуге типа

PB-2 фирмы SbrvaII с ротором SS-34 при комнатной температуре в течение

10 мин.

После декантирования оставшейся жидкости, экстракцию повторяют несколько раз (от 5 до 10 экстракций) описанным выше способом. 3а каждой серией экстракций следует проведение измерений каждого бутанольного экстракта при 328 нм, т.е. при длине волны, соответствующей максимуму поглощения хлоргеновой кислоты, растворен-. ной в растворителе. Коэффициент поглощения хлорогенозой Кислоты на этой длине, волны составляет 51,3. После завершения экстракций с растворителем, твердую Фазу высушивают в потоке азота в течение 3 часов и осадок содержащий хлорогеновую кислоту, исследуют на это соединение.

Зкстракция фенолов и олигосахаридов из измельченной массы подсолнечника, измельченной массы семян хлопка и массы соевых бобов. г.

Приготовление раствора для экстракции фенолов и олигосахаридов из измельченных масс семян подсолнечника, семян хлопка и соевых бобов осуществляют следующим образом: 92 ч,п-бутилового спирта смешивают с 8 ч. водного раствора соляной кислоты с рН,равным 2,30. При этих соотношениях органический растворитель тщательно перемешивается с водной фазой. Полученный растворитель добавляют к измельченной массе, которая подвергается экстрагированию, при различных соотношениях между измельченной массой и растворителем при перемешивании в течение

15 мин при различных температурах.

Значение рН ::успензии поддерживают постоянным в интервале минимальной растворимости протеинов, содержащихся в исследуемой измельченной массе. Постоянное рН обеспечивали путем добавления полунормальной соляной кислоты к перемешиваемой суспензии, или также путем добавления раствора с рН, равным 0,5, образованного 92 ч. п-бути-лового спирта и 8 ч водного раствора соляной кислоты. Суспензию отфильтровывают на фильтровальной бумаге Ватман Р 4, после чего повторяют экстракцию (от 2 до 8 раз) на осадке описанным выше способом. После завершения экстракции полученные таким образом протеиновые концентраты сушат в потоке азота в течение, по крайней мере, 3 часов. На различных порциях сухого материала определяют химический состав в отношении влаги, протеинов, липидов и сырого волокна. На таком концентрате определяют остаточное содержание хлорогеновой кислоты, кофеЯ613144

)ной кислоты, гипосипола, сахарозы, рафинозы и сяхиозы.

Получение протеиновых изолятов.

Концентраты протеина подвергают двум различным способам экстракции протеина: одноступенчатому, неселективному способу экстракции в щелочной среде, и второму двухступенчатому способу, в котором используют фракционирование между растворимыми в воде протеинами с малым молекулярным весом, имеющими высокую электро- 10 форетическую подвижность, и протеинами, которые растворимы в щелочной среде и имеют высокий молекулярный вес с низкой электрофоретической подвижностью. Второй способ обеспечивает получение двух изоляторов с различным составом и свойствами.

Одноступенчатая экстракция.

Часть концентрата протеина, полученного при экстракции, суспензируют в 15 ч. воды, подводят рН раствора до 9,5 с помощью 0,2 NaOH {отношение измельченной массы к растворителю

1/15 вес. к объему) и перемешивают в течение 30 мин при 25 С. .Суспензию центрифугируют со скоростью 17000 об/мин 20 мин на центрифуге типа РВ-2 фирмы SbrvaII с ротором SS-34. Вторую экстракцию при тех же самых условиях повторяют на осадке.

Две всплывшие вверх жидкости соединя- ЗО ются вместе.и осаждают протеины 0,5

HCI до изоэлектрической точки. Осадок отстаивают центрифугированием со скоростью 17000 об/мин, а затем промывают кислым водным раствором. Протеи-. новый осадок удаляют с водной средой, нейтрализуют до рН, равного 7,0 и сушат при температуре ниже нуля.

Двухступенчатый способ экстракции.

1. Часть концентрата протеина обра-4,1 батываВт 15 ч воды с рН, равным 6,5 (отношение измельченной массы к растворителю, вес к объему 1/15) в течение 30 мин с перемешиванием при 25 С.

Суспензию центрифугируют со скоростью

17000 об/мин в течение 20 мин, а вторую экстракцию при тех же условиях осуществляют из остатка. Из двух смешанных всплывающих вверх жидкостей осуществляют осаждение протеинов до изоэлектрической точки. Осадок промывают кислым раствором, снова суспензируют в воде, нейтрализуют до значения рН, равного 7,0, и сушат при температуре ниже нуля.

2. Нерастворимый осадок — протеины, 55 полученный на первой ступени экстракции, растворяют в щелочной среде при рН, равном 9,5 при тех же условиях, которые указывались при осуществленйи одноступенчатого способа экстракции.

В дальнеишем способ поясняется примерами.

Пример 1. Зкстракция хлорогеновой кислоты из семян подсолнечника

Химический состав семян,Ъ:

-Влага 3 8

В сухом веществе:

Протеины 29,9

Липиды 58,7

ХлорогеАовая кислота 1,9

Сырое волокно 2,4

Не содержащие азота экстрагированные вещества 8,7

Зола 314, Измельченная масса семян подсолнечника, полученная описанным выше способом, имела следующий состав,%:

Влага 8,8

В сухом веществе:

Протеины . 64,6

Липиды Менее 1,0

Хлорогеновая кислота 4,8

Сырое волокно 3,9, 10 r измельченной массы, имеющей размер частиц около 0,050 мм, смешивали в колбе с 300 мл растворителя в течение 30 мин при 30 С. Смесь центрифугировали со скоростью 5000 об/мин

10 мин при комнатной температуре, декантировали и повторяли экстракцию с дополнительными 300 мл свежего растворителя. Эту процедуру повторяли последовательно в течение восьми раз (окончательное отношение количества измельченной массы к растворителю 1/240).

Содержание хлорогеновой кислоты в каждом экстракте определяли спектрофотометрическими методами при длине волны 328 нм по отношению к чистому растворителю, результаты этих экспериментов представлены в табл. 1.

Таблица 1

203,5

99,2

53,8

31,0

19,3

7,8

6,2

4,3

B остатке после восьми экстракций, который высушивали в потоке азота в течение 3 часов, содержание хлорогеновой кислоты определяли по методу 14025 A.Î.A.Ñ. После осуществления восьми экстракций содержание хлорогеновой кислоты было менее 0,2%.

7 673144

Пример 2. Получение концентра .тов"протеййа и иэоЛятов из -семян подсолнечника семейства амиата (Jenisei) очищенных от хромогенных соединений и поддающихся ферментации олигосаха*1 ридов.

Получение концентратов протеина, 5 свободных от о-бифенолов и олигосахаридов °

Исйойьзуемая йрй этом измельченная масса имела следующий состав,%:

Влага 1.0,2 10

В сухом вЕществе:

Протеины 58,6

Липиды Менее 1,0

Хлорогеновая кислота 1,56

Кофейная кислота 0,14

Сахароза 4,70

Рафиноза 3,2

Сырое волокно 4,2 .

20 r. обезжиренной измельченной массы семян подсолнечника смешивали в колбе с 400 мл растворителя, образованного 92 ч. и-бутилового спирта и 8 ч. водного раствора соляной кислоты.Экс. тракцию осуществляли в течение 15 мин при 25ОС и перемешивании. Исходное значение рН суспензии равнялось 6,2, в ходе осуществления экстракции его изменяли до 50 и удерживали на этом уровне путем добавления небОльших порций 0,5 N соляной кислоты. Суспензию отфильтровывали в воронке Бюхнера 40 в вакууме с использованием фильтроваль" ной бумаги .Ватмана 9 3, затем проводили повторную экстракцию на твердом осадке, при этом полное количество экстракций доводили до восьми (окон- 35

"""чательное: соотношение между измельченной массой и раствором составляло

1/160).

Полученный. продукт, высушенный в потоке азота в течение 3 часов, имел 40 следующий состав,Ъ:

Влага 12,2

Протеины 72,9

Хлорогеновая кислота Менее 0,05

Кофейная кислота Менее 0,05 45

Сахароза Менее 0,01

Рафиноза Менее 0,05

Сырое волокно 4,8 °

Значения меньше величин, соответствующих"пределу чувствительности применяемых методов.

15 Этот продукт, исходя из содержания в нем протеинов (72), определяли как ковцентрат протеина: он является практически очищенным от олигосахаридов и фенольных соединений, которые определяют зеленый цвет полученного вещества, образованного при экстракции протеинов в щелочной среде. Электрофоретический анализ геля полиакрил- 60 амйда йротеийов,экстрагироваййого из концентрата, показал,что они обладают теми же электрофоретическими характе. ристиками, что и протеины,вьделеиные иэ измельченной массы подсолнечника.

Получение изолятов протеинов путем одноступенчатой экстракции.

10 r концентрата протеина суспензируют в 150 мл водного раствора щелочи с рН, равным 9,5 (отношение содержания измельченной массы к растворителю 1/15, вес к объему) в течение

30 мин при перемешивании и температуре 25 С. Значение рН суспензии поддерживали постоянным на уровне 9,5 в течение всего процесса экстракции путем добавления малых порций разбавленного раствора NaOH. Суспензию центрифугировали со скоростью

17000 об/мин в течение 20 мин, и осадок подвергали экстракции при указанных выше условиях. Объединяли два протеиновых раствора и осаждали 0,5

N HCI при значении рН, равном 5,2.

Осадок отделяли центрифугированием со скоростью 17000 об/мин в течение

10 мин, промывали подкисленной водой

c pH, равным 5,2, снова суспензировали его в воде, нейтрализовали при рН, равном 7,0, затем сушили при температуре ООС. Содержание протеинов в изоляте, всплывающем слое и в нерастворимом осадке, полученными по способу одноступенчатой экстракции, приведены в таблице 2.

Цвет полученного изолята был белым со светло-кремовым оттенком.

Получение изолятов протеинов двухступенчатой экстракции.

П р и„м е р 1 ° 10 r концентрата протеинов добавляли к 150 мл водного раствора с рН, равным 6,5 (отношение содержания измельченной массы к растворителю 1/15 вес к объему), в течение 30 мин при перемешивании и температуре 25оС рН раствора поддерживали постоянным на уровне 6,5 путем добавления малых порций 0,02 N раствора NaOH. Суспензию центрифугировали со скоростью 17000 об/мин в течение

20.мин, а осадок подвергали снова экстракции при тех же самых условиях. ,Цля объединенных протеиновых растворов осаждали 05 N НС1 при рН,равном 40.Осадок отделяли центрифугированием со скоростью 17000 об/мин 10 мин, промывали подкисленной водой со значением рН, равным 4,0, снова суспензировали в воде, нейтрализовали при рН, равном

7,0 и затем сушили при температуре ниже нуля.

Изолят 1 был белого цвета.

Пример 2. Из нерастворимого осадка, полученного при осуществлении вышеописанного способа, осуществляли экстракцию протеинов в щелочной среде при рН, разном 9,5, при тех же условйях, которые были указаны для способа одноступенчатой экстракцик протеинов.

Содержание протеинов в изоляте, всплывающем слое и нерастворимом осадке, полученными при осуществлении

673144

Получение иэолятов протеина одноступенчатым и двухступенчатым способами иэ концентрата семян подсолнечника, очищенного от о-бифенолов и поддающихся ферментации олигосахаридов

72,9 Одноступенчатый (Т) Na0H 9,5

5,2

71,9 Двухступенчатый,.(i) НО

6,5 4,0 5,6 83,3 Белый

5,0

5,2 57,1 98,8 Светлокремовый 4,1 26,3

9,5 (2) НаОН

+ Полное содержание N х 6,25 двухступенчатого способа;-приведены в табл. 2.

Пример 3. Оптимизация способа экстракции о-бифенолов и поддающихся ферментации олигосахаридов иэ семян подсолнечника семейства Атп1а1а(Юеп1- .

se1) с целью получения концентратов протеина.

Используемая измельченная масса семян подсолнечника имела тот же состав, что и масса, использованная в прймере 2.

20 г обезжиренной измельченной массы добавляли в колбу со 100 мл растворителя, обраэованйого 92,ч.п-бутилового спирта и 8 ч. водного раствора НСХ, экстракцию осуществляли в течение 15 Мин при 25 С с перемешиванием. Исходное значение рН суспензии 6,2, а при осуществлении экстракции его поддерживали постоянным и равным 5,0 путем добавления небольших порций 0,05 И HCX. Суспензию отфильтровывали в вакууме и осуществляли восемь экстракций на твердом осадке (окончательное отношение содержания измельченной массы к растворителю составляло 1/40). Полученный про» дукт высушивали в потоке азота в течение 3 часов, он имел следующий состав,Ъ!

Влага 10,8

В сухом веществе:

Протеины 69

Хлорогеновая кислота Менее 0,05

Кофейная кислота Менее 0,05

Сахароза 1,38

Рафиноза 1,33

Сырое .волокно 4,6 + .

Иэ полученных результатов следует, что при изменении соотношения между количеством измельченной массы и растворителем от 1/160 (Пример 1) до

Изолят 2 был белого цвета с светлокремовым. оттенком.

Таблица 2

60,6 95,4 Светлокремовый 10,5 26,9

1/40, остаточное содержание хлорогеновой кислоты и кофейной кислоты остается неизменным (менее, чем 0,05%), в то время экстрагирование сахарозы и рафинозы понижается.

Пример 4. Получение концентратов протеина, имеющих низкое со- держание госсипола,из очищенных от шелухи семян хлопчатника.

Использованная измельченная масса семян хлопчатника имела следующий состав,В.

Влага 10,0

В сухом веществе:

40 Протеины . 47,.6

Липиды Менее 1,0

Свободный госсипол 1,45

Полное количества госсипола . 1,93

Сырое волокно 1„0 .

20 г обезжиренной Измельченной мас-. сы семян хлопчатника помещали в колбу с 400 мл растворителя, образованного

92 ч,п-бутилового спирта и 8 ч. водйого раствора НСХ.Экстракцию осуществляли в течение 15 мин при 25 С и перемешивании. Исходное значение рН суспензии было равно 6,1. При осуществлении экстракции оно поддерживалось постоянным и равным 4,0 путем добавления малых порций 0 5 И НСГ. Суспен(эию отфильтровывали в вакууме на воронке Бюхнера и фильтровальной бумаге Ватмана Р 3 и осуществляли восемь зкстракцнй на твердом осадке (оконча60 тельное отношение измельченной массы к растворителю составляло 1/160) при определенных выше условиях.

Полученный «онцентрат протеина сушили в потоке азота в течение 3 часов, 65 его состав был следующим,Ъ:

12,673144

10,0.I

Формула изобретйяяя

Составитель М. Ларина

Техред О. Андрейко Корректор М. Пожо

Редактор В. Смирягина

Заказ 3721/54

Тираж 568 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

"113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5,Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Влага

На сухом веществе:

Протеины 66,5

Липиды Менее 0,5

Свободный госсипол 0,07

Полное количество госсипола 0,34 5

Сырое волокно 2,7.

Обработка и-бутиловым спиртом и водным раствором HCI обеспечили получение концентрата протеина (66,5% протеина) в условиях, когда не наблюда- {) лось изменения природных свойств продукта, при низком содержании свобод. ного госсяпола и полного госсипола.

Способ, предложенный в настоящем изо бретения, обладает тем преимуществом, что при его осуществлении можно использовать также и измельченную массу семян хлопчатника с высоким содержанием госсипола, которые в настоящее время непригодны для получения из них концентратов и изолятов протеина.

Пример 5. Получение концентратов протеина, имеющих низкое содержание поддающихся ферментацяи олигосахаридов из очищенных от шелухи соевых . бобов семейства А Й а.

26

Химический состав измельченной массы,%г

Влага 11,2

В сухом веществе:

Протеины 53,8 30

Липиды Менее 1,0

Сахароза 8,24

Раффиноза 0,94

Стахиоза 4,70

Сырое волокно 130,35

20 r обезжиренной соевой измельченной массы помещали в колбу с 400 мл растворителя, полученного 92 ч. и-6утилового спирта и 8 ч. водного раствоРа HCI, экстракцию осуществляли в 40 течение 15 мин при 40 С и перемешивании. Начальное значение РН суспензяи было равно 6,3, а в ходе экстракции его доводили . и поддерживаля на уровне 4,5 путем добавления малых порций 45

0,5 N HCI, Суспензию отфильтровывали в вакууме в воронке Бюхнера с использованием фильтровальной бумаги Ватмана Р 3 и повторяли экстракцию на твердом осадке до восьми раз (окончательное отношение измельченной массы к растворителю равно 1/160).

Полученный продукт после высушивания в потоке азота в течение 3 часов имел следующий состав,Вг

В лага 9,3

B сухом веществе

Протеины 65,9

Сахароза 0,41

Раффиноза 0,8

Стахиоза 2,82

Сырое волокно 2,4 ю

Этот продукт rio содержанию протеинов (65,9%) относится к концентратам протеина и имеет небольшую концентрацию поддающихся ферментации олигосахаридов.

Способ получения концентрата протеинов из семян масличных культур, предусматривающий измельчение исходного сырья, экстракцию из него протеинов раствором гидроокиси натрия, отделение экстракта от нерастворимого остатка, осаждение протеинов из раствора экстракта минеральной кислотой с последующим его отделением, нейтрализацией я сушкой, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения биологической ценности получаемого концентрата протеина, перед экстракцией протеинов исходное сырье обрабатыва- . ют. смесью и-бутилового спирта и соляной кислоты .в соотношении 1г5-1:240 при 20-40 С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

Р 507303, кл. A 23 У 1/14, 1974.