Способ отделения протеинов

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

О П

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ

<11 688124 *

1 (61)Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 27.08.76 (21) 2392409/23-04 (51) М. Кл.

С 07 С 103/52//

А 61 К 37/02 (23) Приоритет (32) 28.08.75; 28.07.76

Государстненнв|й комитет

СССР оо делам изооретеннй н отнрмтий (3!) 7526530; 7622985 (33) Франция

Опубликовано 25.09.79. Бюллетень № 35

Дата опубликования описания 30.09.79 (о@) QK 547,964.4..07 (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Франсуа Мейе и Бернар Мирабель (Франция) Иностранная фирма

"Рон-Пуленк Эндюстри" . (Франция) (71) ЗаявитЕль (54) СПОСОБ ОТДЕЛЕНИЯ ПРОТЕИНОВ

Изобретение относится к способу отделения протеинов и средством ионного обмена и может найти примен..ние в биологии, фармацев;ической и пищевой промышленности при очистке сточных вод. 5

В пептидной химии широко используют очистку синтетических и выделенных из природного сырья пептидов ионным обменом (1), (2) и (3).

В качестве ионообменников используют ДЕАЕ-Сефадекс А-50, СМ-Сефадекс С-50 и другие про- щ изводные целлюлозы и декстрана.

Протеи- вводят в колонку, заполненную набухшим носителем в водном или буферном растворе с различными значениями рН и ионной силы. В зависимости от стоящей задачи элюент и 1а ионообменник могут быть подобраны таким образом, что или пептид, илн примеси сорбируют на колонке, а затем в случае сорбции пептида, последний вымывают, меняя ионную силу и рН элюейта.

Недостатками известных способов являются низкая механическая прочность ионообменников, их быстрое старение, уплотнение слоя лри хроматографироваини, что снижает скорость прохождения элюента и удлиняет процесс: изменение

2 ионообменника в зависимости от величины рН и ионной силы рабочей среды; способность их к биологическому разложению и отсутствие возможности их стерилизации, что исключает использование их нри приготовлении фармацевтических препаратов.

Цель изобретения — упрощение процесса отделения протеинов.

Это достигается способом отделения протеинов путем контактнрования протеинов в водном буфере с ионообмеиной смолой и последующего элюирования протеинов буферным водным раствором при изменении ионной силы и рН буфера, заключающимся s том, что в качестве ионообменной смолы используют HopHcrhlll минеральный носитель с размером частиц от 5 мкм до

2 мм, удельной поверхностью от 5 до 150м /r, диаметром пор от 500 до 2500 А, объемом пор ° от 0,4 до 2 мл/г, покрытыи пленкой спппого поперечными связями полимера плотностью от

1,05 до 8,9 мг/м, содержащего нли несущего анионообменные группы,представленные формулами (+ 1 Й-1 — СНр — Н-СНр или СН вЂ” и — (Вз) Х

R з 63312 где R.èìååò одинаковые или различные значения и является алкилом или гидроксиалкилом C — С,.

Х вЂ” хлорид, сульфат, нитрат, фосфат или цитрат, либо катионообменные группы, например, карбоксильную или сульфогрупгу с ионообменной способностъю от 0,3 до 1,95 мэкв/г.

Предпочтительно использование в качестве минерального носителя окиси алюминия или двуокиси кремния и в качестве сшитого поперечными связями полимера — продукта полимеризации 10 эпоксидных соединений и полиаминов; смеси виниловых мономеров; стирола и его производных; акрилочой кислоты, метакриловой кислоты с полифункциональными мономерами (диакрилат или диметакрилат моно- или полиалкиленгликоля, ви 15 нилтриалкоксисилана или винилтригалогенсилана) .

Преимуществом способа являет: я ускорение процесса, так, например, при очистке альбумина и при выделении1 -глобулина из сыворотки крови скорость процесса составляет 180 и 100мл/час 20 соответственно.

1<роме того, увелишвается срок службы смолы. После ll0 последовательно проведенных операций никаких признаков старения смолы не было обнаружено.

Предлагаемый способ позволяет отделять протеины от их растворов, таких как молочная сыворотка (лактосерум), пиво, кровь, органические экстракты и все промышленные стоки; от остаточных продуктов скотобойни, пищевого производства, крахмального производства, являясь, таким образом, средством очистки указанных сточных продуктов.

Отделение протеинов достигается в результате контактирования обрабатываемого pacraopa при температуре, и таких значений ионной силы и рН, которые обеспечивают совместимость протеинов с ионообменной смолой, выбор которой определяется условиями отделения протеинов. Таким образом, на ионообмешюй смоле 4О происходит фиксация либо требуемого протеина, либо других протеинов, содержащихся в растворе, либо всех протеинов раствора.

В случае, когда нужно получить несколько протеинов, их отделение и концентрирование может быть д, стигнуто контактироваиием об.рабатываемого раствора последовательно с несколькими катионообме пгыми смолами или с несколькими катионо- и анионообменными смолами. Таким образом, возможна выборочная фиксация протеинов из раствора на каждой смоле.

В случае, если требуемый протеин фиксируется на смоле из протеинового раствора, то затем его отделяют элюированием раствором, имеющим величину рН и ионную силу, отличные от величины рН и ионной силы фиксируемого раствора, но совместимые с протеином, 4 Хаким образом, достигается ке только отделение протеина от раствора, но и его очистка и концентрирование. Так, например, можно отделять и концентрировать альбумин, пенсии, протеины лактосерума посредством анионообменной смолы и лиэоцим посредством катнонообменной смолы, Если же необходимо, чтобы требуемый протеин остался в протеиновоьь,:растворе,то при этом фиксируют другие протеины смеси, происходит отделение требуемого протеина от других протеинов и, таким образом, обеспечивается его очистка. Элюирование фиксированных протеинов приводит к избирательному или неизбирательному отделению протеинов и ихконцентриро-. ванию,Аналогично происходит отделение -глобулина посредством анионообменной смолы.

В случае, когда несколько требуемых протеинов фиксируется на смоле одновременно, то элюирование раствором с величиной рН и ионной силой отличными от величины рН и ионной силы фиксируемого раствора приводит к разделению протеинов и их концентрированию. Элюирование растворами с повышенными значениями рН и ионной силы приводит кроме избирательного отделения протеинов к их очистке и концентрированию, В цанном случае это относится, главным образом, к сыворотке.

Если есть необходимость удалить протеины, они фиксируются на смоле из их раствора. Таким образом получают очищенные от протеинов растворы, Элюироваиие фиксированных протеинов позволяет повторно использовать смолу. В частности, это относится к осветлению пива и обработке растворов, содержащих гемоглобин, посредством кагионообменных смол.

Отделение протеинов можно осуществлять с идентичными результатами как прерывным, так и непрерывным способом.

Полученные результаты практически не зависят от концентрации обрабатываемого раствора, но зависят or типа ионообменной группы смолы, величины рН, ионной силы и расхода как обрабатываемого раствора, так и раствора элюирования.

Пр имер 1. Получение ионообменной смолы.

100 г двуокиси кремния с размером частиц от 100 до 200 мкм, удельной поверхностъю

24 м /г, средним диаметром лор 1400 А и объемом пор 1 мл/г сушат при 150 С прн пониженном давлении пять часов. Полученную высушенную двуокись кремния вводят в раствор, содержащий 250 мл хлористого метилена, 60 мл перегнаииого стирола, 20 мл винилтриэтоксисилана и 0,5 г азобис-изобутиронитрила. Хлористый метилен испаряют при температуре окружающей среды и пропитанную двуокись кремm)

1+> (-1 сн,-к- сн а

5 6881 ния нагревают при 120 С шесть часов при давлении 3 бара.

Из приготовленной двуокиси креь.сия получают суспензию в 300 мл ксилола, нагревают ее при температуре кипения два часа. После

5 фильтрации двуокись кремния промывают в ацетоне, а затем высушивают.

50 г полученной двуокиси кремния суспензируют в 180 г хлорметилового эфира, содержащего 6 r четыреххлористого олова, затем 10 смесь нагревают с обратным холодильником в

1течение четырех часов в безводной среде. После охлаждения двуокись кремния отжимают, про. мывают 200 мл смеси диоксан/вода (50:50), содержащей 10 мл соляной кислоты, а затем 15 водой до.нейтральной реакции и сушат.

Содержание углерода составляет 4,1%, хлора — 1,90%.

Полученный продукт суспензируют в 150 мл водного раствора, содержащего 30% триметил- 20 амина, и выдерживают 8 дней при комнатной температуре. Отжимают, промывают, получают ионообменную смолу, несущую функциональные группы:

24 6

Пр имер 3. Аналогично примеру 1, но злюирование протеина проводят 0,05 М буферным раствором цитрата (рН 6,5). Получают 59 мл раствора альбумина концентрацией 2,5 вес.%.

Пр имер 4..Обработку раствора альбумина проводят аналогично. примеру 1, но используя

41 г ионообменной смолы в колонке диаметром 1 см и при расходе элюента 80 мл/час.

Получают раствор альбумина с концентрацией 7 вес.%.

Установлено, что увеличение высоты колонки и уменьшение скорости элюирования приводит к увеличению концентрации получаемого раствора.

Пример 5. Получение ионообменной смолы.

В 150 мл хлористого метилена, содержащегося 6,5 r й, N-бис-(эпокси-2, 3-пропил)-этиламина и 3 r триэтилентетраамина, вводят 50 г двуокиси кремния с размером частиц от 40 до

100 мкм, удельной поверхностью 37 м /r, диаметром пор 1100 A и объемом пор 1,05 мл/1.

Хлористый метилен испаряют при температуре окружающеК среды; пропитанную двуокись кремния нагревают при 60 С 60 ч, и промывают кипящей водой, а затем ацетоном.

Получают смолу, состоящую из двуокиси кремния, покрытую сшитым полимером, содержащую функциональные группы.

CH — И-1 "

2 2

С2пз

СБ3

30 которая имеет следующие характеристики: содержание углерода 4,8%; содержание хлора 2%; содержание азота 0,9%; количество осажденного полимера 3,3 мг/м; ионообменная способность 0,5 мэкв/г.

Обработка раствора альбумина.

10 г полученной ионообменной смолы вводят в колонку диаметром 1 см и оставляют под давлением, после чего 0,01 М буферным раствором фосфата рН смолы доводят до 6,5.

Раствор альбумина с концентрацией 1 вес.% в том же буферном растворе вводят со скоростью 180 мл/час до насыщения колонки, что соответствует примерно 200 мл раствора. Затем смолу промывают 100 мл буферного раствора.

Фиксировачный альбумин элюируют путем перколяции раствора !MNaCP в том же буферном растворе, расход которого составляет 180 мл/час, 45 мл раствора обеспечивает извлечение альбумииа с концентрацией 3,3 вес.%. Таким обра50 зом, смола имеет ионообменную способность с альбумином порядка 150 мг/г, что позволяет концентрировать раствор альбумина.

После тридцати последовательных операций не обнаружено никаких признаков старения ионооб55 менной смолы, П р имер 2. Аналогично примеру 1, используя раствор альбумина с концентрацией 0,2 вес.%, получали такие же хорошие результаты. которая имеет следующие характеристики: содержание углерода 8,8%; содержание азота

2,4%; количество оса кденного полимера 3,3 мг/м, ионообменная способность 1. мэкв/г.

Отделение 1 -глобулина.

10 r полученной ионообменной смолы вводят в колонку диаметром 1 см и оставляют под давлением. Смолу подкисляют 1 н. раствором соляной кислоты, затем добавляют 0,02 М буферный раствор фосфата, доводят величину рН до

6,5. Осуществляют перколирование 20 мл лишенного липидов и лиофилизованного 1 вес.%-ного раствора сыворотки. В том же буферном растворе фосфата. Расход раствора 100 мл/час.

Смолу промывают 50 мп того же буферного раствора фосфата. Раствор, выходящий иэ колонки, содержит чистый 1 -глобулин. .тугие протеины, а именно а-глобулины, Рглобулины и альбумин, которые присутствуют в исходном растворе, фиксируются на смоле.

Их извлекают элюированием ЗМ раствором

NaC3 в том же буферном фосфатном растворе.

Если проводить элюирование буферным раствором повышенной ионной силы, то с увеличением концентрации NaC2 получают растворы, обогащенные а-глобултпими, Р-глобулинами и аль бумином.

124 8

0,1 М цитраттидрата окиси натрия (рН 7). Полученный раствор содержит все фиксированные протеины концентрацией 4 вес.%.

Такая операц1 я обеспечивает получение смеси чистых протеинов, не содержащих лактозу, в более концентрированном растворе, чем исходный раствор.

После тридцати последовательных операций не обнаружено никаких признаков старения ионообменной смолы.

П р и м ер 8. Обработка раствора пепсина.

3 г иояообменной смолы, как в примере 1, вводят в колонку диаметром 1 см.

Смолу промывают 100 мл дистиллированной воды, затем перколируют 150 мл раствора сырого пепсина, содержащего 20 ед. пепсина/мл при расходе раствора 100 мл/час. Смолу промывают 20 мл дистиллированной воды.

Раствор, выходящий из колонки, и водные промывки не проявляют активности; весь пенсии фиксируют на смоле. Загрязнения остаются в растворе. Фиксированный пепсия элюируют перколяцией 1 М раствором МаСь Расход раствора 100 мл/час, 16 мл этого раствора обеспечивает извлечение 170 ед. пепсина/мл раствора.

Установлена высокая концентрация полученного раствора. После промывки 50 мл дистиллированной воды смола может быть использована повторно.

После десяти последовательных операций не обнаружено никаких признаков старения ионообменной смолы.

Пр имер 9. Получение ионообменной смолы.

100 r двуокиси кремния с размером частиц от 100 до 200 мкм, удельной поверхностью

25 м /г, средний диаметр пор 1400 А и объем пор 1,1 мл/г, пропитывают раствором 200 мл хлористого метилена, содержащего 24 r акриловой кислоты, 6 r диметакрилата диэтиленгликоля и 0,4 г перекиси бензоила.

Хлористый метилен испаряют при температуре окражующей среды и атмосферном давлении до постоянного веса; затем пропитанную двуокись кремния нагревают при 80 С в течение 6 ч.

Суспенэию двуокиси кремния в 300 мл воды кипятит шесть часов, Отфильтровывают, промывают в ацетоне, сушат в вакууме при 80 С.

Получают ионообмеиную смолу, несущую функциональные группы СООН, которая имеет следующие характеристики: содержание углерода

10„55%„ количество осажденного полимера

7,2 ыг/м; иоиообменная способность 1,05 мэкв/г.

2 °

Обработка раствора лизоцима.

10 r получе пюй ионообменной смолы вво1О

688

Пример 6. Получение ионообменной смолы.

Аналогично примеру 5, но используя двуокись кремния с размером частиц от 100 до

200 мкм и 6,5 г N,N-бис- (зпокси-2,3-пропил)-бутиламина.

Получают ионообменную смолу, состоящую из двуокиси кремния, покрытой сшитым полимером, содержащую функциональные группы — СН -Н-СН

С4Нд которая имеет следующие характеристики: содержание углерода 9,2%, содержание азота 2,5%; количество осажденного полимера 3,2 кг/м, ионообменная способность 1,1 мэкв/г.

Экстракция протеинов.

10 г полученной ионообменной смолы вводят в колонку диаметром 1 см и оставляют под давлением. Смолу подкисляют 0,1 н. раствором соляной кислоты, а затем 0,01 M буферным раствором фосфата до рН 7,5. 20

Проводят перколяцию в том же буферном растворе фосфата 30 мл 1 вес.%-ного раство-. ра ультрафнльтрованного лактосерума, содержа- щего 75 sec.% протеинов, при расходе раствора 80 мл/час. Смолу промывают 100 мм того же буферного раствора фосфата.

Раствор, выходящий иэ колонки, содержит жировые продукты и лактозу, присутствуннцую в исходном растворе.

Протеины, лактоальбумины, лактоглобулины, зо сывороточный альбумин (серумальбумин) и незначительная часть иммуноглобулияов, присутствующих в исходном растворе, фиксируют на смоле. Путем элюирования буферным раствором Мак Ильваина (0,05 М, рН 4) извлекают З5 отделенные и очищенные протеияы.

Пример 7. Экстракция протеинов.

20 r ионообмеяной смолы, аналогичной примеру 1, но с размером частиц от 200 до 500 мкм,, вводят в колонку диаметром 2,5 см и оставля- 40 ют под давлением.

Смолу подкисляют 0,1 н раствором соляной кислоты, затем 0,01 М буферным раствором

HCE до рН 7.

Осуществляют перколяцию 600 мл получен- 4> ного раствора, состоящего из 300 мл буферного раствора HCI и 300 мл лактосерума, яе содержащего липидов, с концентрацией растворимьгх протеинов 0,5%, при расходе раствора

300 мл/час. Затем смолу промывают 100 мл буферного раствора.

Раствор, выходящий из колонки, содержит лактозу, присутствующую в исходном растворе.

Протеины: лактоальбумины, лактоглобулины, серумальбумин и незначительная часть иммуноглобулинов, присутствующие в исходном растворе, фиксируют на смоле. Их элюируют пропусканием через колонку буферного раствора дят в колонку диаметром 1 см и оставляют

124 10

Осуществляют перколяцию 500 мл раствора гемоглобина концентрацией 0,2 вес.% в том же буферном растворе, скорость пропускания раствора через колонку 100 мл/час. Гемоглобин адсорбируется на ионообменной смоле. Выходящий иэ колонки бесцветный раствор не содержит гемоглобина.

Адсорбированный гемоглобин элюируют перколяцией 0,5 М раствором карбоната аммония, затем колонку промывают сначала 300 мл 0,1 н. гидрата окиси натрия, затем 50 мл 1 í. HCI.

Пример 11. Приготовление анионообменной смолы.

100 г двуокиси кремния с размером часпщ от 100 до 200 мк, удельной поверхностью

2 о

24 м /г, средний диаметр пор 1400 А и объем пор 1 мл/г, сушат 5 ч при 150 С и при пониженном давлении, Сухую .двуокись кремния диспергируют в растворе, содержащем 250 мл хлористого мегиона, 60 мл перегнанного стирола, 20 мл винилтриэтоксисилана и 0„5 r азобисизобутиронитрила.

Хлористый метилен испаряют при комнатной температуре, а пропитанную двуокись кремния

6 ч выдерживают при 120 С и давлении 3 бара.

Суспензию двуокиси кремния в 300 мл ксилола выдерживают 2 ч при температуре кипения. Двуокись кремния отфильтровывают и промывают ацетоном, сушат.

Показано, что содержание углерода составляет 4 вес.% по отношению к покрытой двуокиси кремния.

50 г полученной двуокиси кремния суспен-," дируют в смеси 180 г хлорметилового эфира и

6 r хлорного олова, затем смесь нагревают 4 ч с обратным холодильником.

После охлаждения двуокись кремния отжимают, промывают 200 мл смеси равных количество диоксана и воды, содержащей 10 мл хлористоводородной кислоты, затем водой до нейтрального значения рН, и, наконец, сушат.

Содержание углерода составляет 4,1%, хлора — 1,90%.

Полученное вещество превращают в суспензию в 150 мл 30%-ного водного раствора триметиламина и выстаивают 8 дней при комнатной температуре.

Фильтруют, промывают и получают ионообменную смолу, несущую функциональные группы: снд которая имеет следующие характеристики: содержание углерода 4,8%; содержание хлора 2%;.

688 под давлением, после чего смолу переводят в

Ф

NH4-форму проводят перколяцию двух литров водного 0,5 М раствора ацетата аммония при рН 8,2. Величину рН смолы доводят до 6,5 добавлением 100 мл 0,02 М буферного раствора

5 трис-малеиновой кислоты.

Перколяцию раствора лизоцнма концентрацией 1 вес.% проводят в том же буферном растворе при расходе 180 мл/час, до насыщения колонки, что соответствует примерно 200 мл раст-1о вора. Затем смолу промывают 100 мл 0,02 M буферного раствора трис-малеиновой кислоты с величиной рН 8,2.

Фиксированный лизоцим элюируют перколяцией 1 М раствором NaCI в том же буферном t5 растворе, со скоростью 180 мл/час, 50 мл раствора обеспечивает извлечение лизоцима. Получают раствор лизоцима с концентрацией 2,5 вес.%.

Показано, что смола имеет ионообменную способность в отношении лизоцима 125 мг/г, 20 что позволяет концентрировать раствор лизоцима.

П р имер 10. Получение ионообменной смолы.

100 г двуокиси кремния с размером частиц 25 от 100 до 200 мкм, удельной поверхностью

37 м /г, средний диаметр пор 1200 А и объем пор 0,95 мл/г, пропитывают раствором 150 мл хлористого метилена, содержащим 60 мл стирола, 20 мл винилтриэтоксисилана и 05 г азобис- ЗО из обутиронитр ила.

Хлористый метилен испаряют при температуре окружающей среды при атмосферном давлении до достижения постоянного веса, после чего пропитанную двуокись кремния нагревают 3S при 120 С в течение шести часов.

Суспензцию двуокиси кремния в 300 мл ксилола нагревают при температуре кипения в течение шести часов. Двуокись кремния отфильтровывают и промывают в ацетоне, сушат при 80 С.4О

50 г модифицированной двуокиси кремния суспензируют в 500 мл хлороформа к суспензии по каплям добавляют раствор 50 r Н$0зС1 в 50 мл хлороформа. Смесь перемешивают при

50 С четыре часа, фильтруют, двуокись крем- 45 ния пром вают водой до нейтрального состояния, ацетоном и сушат в вакууме при 80 С, Получают ионообменную смолу, несущую функциональные группы — 80з Н, которая имеет следующие характеристики: содержание углерода 4%; содержание серы 1,4%, количество осажденного полимера 2,8 мг(м ; ионообменная способность 0,43 мэкв/г.

Э кстракция гемоглобина.

10 г полученной ионообменной смолы вводят в колонку диаметром 1 см, величину рН смолы доводят до 6,5 0,02 M буферным раствором фосфата !

1(+) (-)

G CHl N CH3Cl

688124

10!

35

55 содержание азота 0,9%; количество зафиксированного полимера 3,3 мг/м ; ионообменная способность 0,5 мэкв/г.

Обработка молочной сыворотки.

20 г анионообменной смолы помещают в колонку диаметром 2,5 см (колонка 1).

10 г смолы, полученной в примере 9 помещают в колонку с диаметром 2,5 см (колонка 2).

Две колонки устанавливают последовательно, смолу промывают 500 мл воды.

500 мл Молочной сыворотки подщелачивают до рН 7,5 0,1 í. NaOH, фильтруют для удаления нерастворимых примесей и перколируют в колонке 1 и затем в колонке 2 со скоростью

300 мл/час.

После осаждения протеинов трихлоруксусиой кислотой, показано, что выходящая из колонки

2 молочная сыворотка не содержит протеина.

Смолу s обоих колонках промывают 100 мл воды.

Протеины: лакталбумины, лактоглобулины, серумальбумин и очень небольшая часть иммуноглобулинов, присутствующие s исходном составе, фиксируются на смоле в колонке 1. Их злюируют как описано в примере 7.

Протеины, зафиксированные на смоле в колонке 2 являются, главным образом, незафиксированными на смоле из колонки 1 иммуноглобулинами. Их элюируют перколяцией 1 М раствора карбоната аммония. Концентрация иммуноглобулинов в полученном растворе составляет около 3 вес.%. Иммуноглобулины составляют около 16 вес.% всех протеинов, содержащихся в исходном растворе.

Перед повторным использованием колонки промывают 500 мл воды.

После десяти последовательных операций не обнаружено никаких признаков старения ионообменной смолы.

Пример 12. Извлечение протеинов из nusa.

60 г ионообменной смолы, полученной в примере 9, помещают в колонку диаметром 2,5 см и промывают 250 мл воды.

3 л неосветленного пива перколируют со скоростью 100 мл/час. Выходящее из колонки пиво не дает осадка при добавлении пикриновой кислоты и имеет характеристики осветвленного пива.

Зафиксированные. на смоле вещества являются, главным образом, протеинами. Их элюируют перколяцией 400 мл 0,1 н. хлористоводородной кислоты.

Перед повторным использованием смолу промывают 250 мп воды.

П р и и ер 13. Получение ионообменной смолы.

100 r двуокиси кремния с размером частиц от 0,5 до 2 мм, удельной поверхностью 5 м /r, средним диаметром пор 2500 А, объемом пор

0,4 мл/г, сушат при 150 С, при пониженном давлении 5 ч. Полученную сухую двуокись кремкремния вводят в раствор из 250 мл хлористого метилена, 60 мл стирола, 20 мл винилтрихлорсилана и 0,5 r азобис-изобутиронитрила.

Хлористый метилен выпаривают при комнатной температуре, затем пропитанную двуокись кремния нагревают при 120 С 6 ч и давлении 3 бар.

Двуокись кремния суспендируют в 300 мл ксилола и кипятят 2 ч. После фильтрования двуокись кремния промывают ацетоном, сушат.

Содержание углерода составляет 3,2 вес.% по отношению к покрытой двуокИси кремния.

50 г полученной двуокиси кремния суспендируют в 180 г хлорметилового эфира, содержащего 6 г хлорного олова, затем смесь кипятят с обратным холодильником 4 ч в безводной среде. После охлаждения двуокись кремния обезвоживают, промывают 200 мл смеси диоксана и воды (50:50), содержащей 10 мл соляной кислоты, затем водой до нейтральной реакции и, наконец, сушат.

Содержание углерода составляет 3,8% и количество хлора 1,80%.

Полученный продукт суспендируют в 150 мл

30%-ного водного раствора трибутиламина и выдерживают 8 дней при комнатной температуре, После обезвоживания полученной получают ионообменную смолу несущую функциональные

FP l:

СН3

11+) <-1

Q CHg N — Cy Hg <>

CH) которая имеет следующие характеристики: содержание углерода 4,7%; содержание хлора

1,8%, содержание азота 0,5%; содержание фиксированного полимера 3,3 мг/м; ионообменная способность 0,3 мэкв/г.

Обработка раствора альбумина, 10 r полученной ионообменной смолы поме- щают в колонку диаметром 1 см и оставляют под давлением и 0,01 М буферным раствором фосфата рН среды доводят до 6,5.

Раствор альбумина с концентрацией 1 вес.% в 0,01 М буферном растворе фосфата (рН 6,5) пропускают через колонку со скоростью

180 мл/час до насыщения, что соответствует приблизительно 200 мл раствора. Затем смолу промывают 100 мл этого же буферного раствора.

Фиксированный альбумин извлекают, элюируют 1 M раствором йаСг в этом же буфере со скоростью 180 мл/час. 50 мл раствора пред13 6881 ставляют собой раствор альбумина с концентрацией 1,8 вес.%. Показано, что ионообмепник имеет объем альбумина 90 мг/г, он позволяет концентрировать раствор альбумина. После 30 оследовательных рации Не обнару ких признаков старения ионообменной смолы.

Прим е р 14. Получение ионообменной смо20

Фиксированный лизоцим элюируют 1 М раствором йаСг. в таком же буфере, скорость пропускания раствора 180 мл/час, 50 мл раствора позволяют рекуперировать лизоцим и полу50 чать раствор лизоцнма с концентрацией 2,8вес.%.

Показано, что обменник имеет объем лизоцима 140 мг/г и что он позволяет концентрировать раствор лизоцима.

Пример 15. Получение ионообменной смо55 лы.

100 г Окиси алюминия с размером частиц от 5 до 50 мкм, удельной поверхностью 150 м /г; средним диаметром пор 500 А и объем пор 0,9 мл/г, лы.

100 г двуокиси кремния с размером частиц от 100 до 200 мкм, удельной поверхностью 0

50 м /г, средний диаметр пор 650 А и объемом пор 1,05 мл/г, пропитывают раствором из

200 мл хлористого метилена, 34 г акриловой кислоты, 6 г диметакрилата диэтиленгликоля и

0,4 г перекиси бензоила. 15

Хлористый метилен выпаривают при комнатной температуре и атмосферном давлении до постоянного веса; пропитанную двуокись кремния нагревают до 80 С 6 ч, Затем двуокись кремния суспендируют в

300 мл воды и кипятят 6 ч, отфильтровывают, промывают ацетоном и сушат в вакууме при 80 С.

Получают ионообменную смолу, несущую функциональные группы — COOH, которая име- 25 ет следующие характеристики: содержание углерода 13,2%; содержание фиксированного полимера 9,8 мг/м; обменная способность 1,95 мэкв/г.

Обработка раствора лизоцима.

10 г полученной обменной смолы помещают в з0 ,колонку диаметром 1 см и оставляют под давле+ нием, затем смолу переводят в форму NH4, пропуская через нее 2 л 0,5 M раствора ацетата аммония до рН 8,2.

Затем рН смолы доводят до 6,5 при номо- as щи 100 мл буферного раствора 0,02 М трималеиновой кислоты.

Раствор лизоцима с концентрацией 1 вес.% фильтруют в этом же буферном растворе со скоростью 180 мл/час, до насыщения колонки, что соответствует приблизительно 200 мл раствора. Смолу промывают 100 мл 0,02 М буферного раствора трималеиновой кислоты до рН

8,2.

24 14 сушат при 150 С при пониженном давлении

5 ч.

Полученную сухую смесь алюминия вводят в раствор из 250 мл хлористого метилена, 60 мл перегнанного стирола, 20 мл винилтриэтоксисилана и 0,5. г азобисизобутиронитрила.

Хлористый метилен выпаривают при комнатной температуре, затем пропитанную окись алюминия нагревают до 120 С 6 ч, при давлении

3 бар.

Затем окись алюминия суспендируют в 300 мл ксилола и суспензию кипятит 2 ч. Фильтруют, окись алюминия промывают ацетоном, сушат.

50 г Полученной окиси алюминия суспендируют в 180 г хлорметилового эфира, содержащего

6 r х лоoрpнHоoiго o оoл оoв0а, затем смесь кипятят обратным холодильником 4 ч в безводной среде, После охлаждения окись алюминия отфильтровывают, промывают 200 мл смеси диоксан вода (50:50), содержащей 10 мл соляной кис лоты, затем водой до нейтральной реакции и сушат.

Полученный продукт суспендируют в 150 мл

30%-ного раствора триметиламина и выстаивают 8 дней при комнатной температуре.

После обезвоживания и промывки получают ионообменную смолу, несущую функциональные группы:

CH)

Iæ (-)

СHg — N — Сн) С1 которая имеет следующие характеристики: содержание утлерода 8,2%; содержание хлора 3,7%; содержание азота 1,5%; содержание фиксированного полимера 105 мг/м; обменная способность 1,1 мэкв/г.

Обработка раствора альбумина.

10 г полученной обменной смолы помещают в колонку диаметром 1 см и оставляют под давлением, затем 0,01 М буферным раствором фосфата доводят рН среды до 6,S.

Раствор альбумина с концентрацией 1 вес.% фильтруют в этом же буферном растворе, со скоростью 60 мл/час, до насыщения колонки, что соответствует приблизительно 140 мл раствора. Затем смолу промывают 100 мл такого же буферного раствора.

Фиксированный альбумин извлекают элюиро. ванием 0,1 н. раствором HCI со скоростью

60 мл/час; 25 мл раствора позволяют рекуперировать альбумин с концентрацией 45 вес.%.

Показано, что обменник имеет объем апьбумина 100 мг/г н что он позволяет концентрировать раствор альбумина.

Пример 16. Аналогично примеру 15, из

100 r окиси алюминия, с размером частиц

6881

Формула изобретения

1. Способ отделения протеинов, путем KorrraK30 тирования протеинов в водном буфере с ионообменной смолой и последующего элюирования протеинов буферным водным раствором при изменении ионной смолы и рН буфера, о т л um a ю шийся тем, что, с целью упрощения про 35 цесса, в качестве ионообменной смолы используют пористый минеральный носитель с размером часпщ от 5 мкм до 2 мм, удельной поверхностью от 5 до 150 м /г, диаметром пор от 500 до 2500 А, объемом пор от 0,4 до

2 мл/г, покрытый пленкой сшитого поперечными связями полимера плотностью от 1,05 до

8;9 мг/м, содержащего анионообменные грушты, представленные формулами где R имеют одинаковые или различные значе- ° ния и являются алкнлом или гидроксиалкилом M

С, -С4, Х вЂ” хлорид,сульфат,иитоат,фосфат или щпрат, либо катйонообменные группы; карбоксильl5 от 5 до 50 мкм, удельной поверхностью

110 м /г, средним диаметром пор 750 А и объ. емом пор 1,8 мл/г получают 30 мл раствора альбумина с 4,5 вес.%. Ионообменник имеет объем альбумина 135 мг/г и позволяет концентрировать раствор альбумина.

f1 р имер 17. Аналогично примеру 15, чз

400 r окиси алюминия получают ионообменную смолу, которую разделяют на 4 части и каждую из них суспеццируют в 400 мл 1 М растворов, содержащих соответственно: суль. фат калия, фосфат калия, щпрат натрия, цитрат натрия.

Через 30 мин контакта при комнатной температуре, при перемешивании, смолу обезвоживают и промывают водой.

Получают 4 ионообменные смолы, несущие функциональные группы, аналогичные группам примера 15, но в которых Сг ) заменяется соответствующим количеством анионов сульфа- 2о та, фосфата, нитрата, цитрата.

Применение для обработки раствора альбумина в таких же условиях, как и примере 15, эти 4 смолы дают результаты, идентичные результатам, полученным в примере 15. 25

24 16 ную или сульфогруппу с ионообменной способностью от 0,3 до 195 мэкв/г, 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что минеральный носитель представляет собой двуокись кремния или окись алюминия.

3. Способ по и. 1, отли чающийся тем, что в качестве сшитого поперечными связями полимера используют продукт полимеризации зпоксидньи соединений и полиаминов; смесь виниловых мономеров; стирола и его производных, акриловой кислоты, метакриловой кислоты с полифункциональными полимерами (диакрилат или диметакрилат моно- или полиалкиленгликоля, винилтриалкоксисилана, винилтригалогенсилана) .

Приоритет по признакам:

28.08.75 — используют пористый минеральный носитель с размером часпщ от 5 мкм до 2 мм, удельной поверхностью от 5 go 150 м /г, диаметром пор от 500 до 2500 А, объемом пор от

0,4 до 2 мл/г; покрытый пленкой сшитого поперечными связями полимера ot 1,05 до 8,9 мг/м, содержащего анионообменные группы, представленные формулами

L+) I)

-СНа-й-CHi — или — СН,-N-(R3) Х

Ф з где R имеют одинаковые или различные значения и являются алкилом или гидрооксиалкилом Cr С4

1 )

Х вЂ” хлорид, сульфат, нитрат, фосфат или цитрат с ионообмениой способностью от 0,3 до

1,95 мэкв/г.

Приоритет по признакам:

28.07.76 используют пористый минеральный носитель, содержащий катионообменные группы . карбоксильную или сульфогруппу.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Wachsmuth E. О., Peteiderer g. Biochemische untersuchungen an Kristallinen Jsozymen

der Lactatdehydrogenase ans menschlichen Organ. — Biochemische Zeitschrift, 1963, 336, с. 545.

2. Dozy А. М., НЫатап Т. Н. J. Studies

on the hetегоgeneity of hemoglobin. XIV. Chrornatography of normal and abnormal human hemohlobin types on см Sephadex. — А Chromatography, 1969, 40, с. 62 (прототип).

3. Stauford Moore, Stein W. H. Columu

chromatography of Peptide and Proteins. Advances in Protein Chemistry. — NemrJork: Acod.

Press Jnc., 1956, 11. с. 191 — 236.

ЦНИИПИ Заказ 5557/56 тираж 513

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Подписное