Способ получения пептидов или их солей
{11) 7ООО6О,ФИ ивов реМйия (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено OR0776 (21) 2379653/23-Q4 (23) ПРиоРитет - (32) 11. 07. 75 (3l ) 7507974-9 (33) Швеция
Ъ
Опубликовано 25,1179.Бюллетень,% 43
Дата опублинования описания 25.11.79 (53) N. Кл.
С 07 С 103/52
A 6l К 37/02
Государственный комитет
СССР но делам изобретений н открытий (53) УДК 547.964.4 °.07(088.8) Иностранцы
Бу Турессон аф Экенстам, Лейф Эрик Аурелл, Карл Иеран
Клаэсон, Биргитта Гунилла Карлссон, Стиг Ингемар Густавссон и Гун Анита Олаусон (Швеция) Иностранная фирма АКТИЕБОЛАГЕТ КАВИ (Швеция) P3) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ ИЛИ ИХ
СОЛЕЙ
Изобретение относится к способу получения пептидов - новых биологи чески активных соединений, которые могут найти применение в биохимии и медицине, В химии пептидов широко используют метод постепенного наращиваь.. :< пе- тндной цепи путем конденсации активированных аминокислот, например, способом активированных эфиров (1).
Цель изобретения — синтез новых пептидов, содержащих хромогенную группу и обладающих биологической активностью.
Это достигается согласно описываемому способу получения пептидов общей формулы l.
D-Аз A2 A -NHRq где A„- аланил-, валил-, лейцил", пропил-, пипеколйновая кислота;
A - аланил- валил- глицил-, 2.
1 У лейцил-, изолейцил-, фенилаланил-, азетидинкарбо" новая кислота;
h -- аргинил, лиэил;
 — нитрофенил, или их солей, заключающемуся в том,,что соеди- нения общей формулы
Н Ы вЂ” R, где В имеет указанные значения, подвергают взаимодействию с соответствующей аминокислотой и далее требуемую пептидную структуру постепенно наращивают путем сочетания остальных аминокислот, причем R используют в качестве защитной группы для С-концевого карбоксила первой аминокислоты.
Реакцию сочетания двух аминокислот или депиптида и аминокислоты
® проводят после активирования с(.-карбоксильной группы. Активированное производное может представлять собой, например, паранитрофенил, трихлорфенил, пентахлорфенил, N-оксисукцинимид или N-оксибензотриазоловый эфир, симметричный или асимметричный ангидрид или азид кислоты.
Синтез пептида состоит в ступенчатом добавлении аминокислот к
С-концевой аргинильной или лизильной группе, снабженной хромофорной группой, действующей затем как группа, защищающая карбоксил.
200060
Для защиты с6-аминогрупп применяют карбобензокси или трет,-бутилаксикарбонил или такие родственные им группы, как, например, параметокси, паранитро- или параметоксифенилаэокарбобенэакси.
Для защиты д -гуанидиновой функции аргинильной группы используют протониэацию группы НО или пара" толуалсульфонил; Я -амйногруппы в лизине защищают карбобенэокси-, трет,-бутилоксикарбонил- или паратолуолсульфонильной группой; с(;карбоксигруппу защищают метиловый, этиловый или бензиловый эфир.
В описании использованы следующие сокращения:
Аминокислоты (в левовращающей форме„ кроме особо отмеченных слу-. чаев): Арг — аргинин; Аэо — 2-аэетидинкарбоновая кислота; Ала " ала" нин; Гли — глицин; Иле — иэолейцин;
Лей — л«ейцин; Лиз - лизин; Фе — феНилаланин; Пип — пипеколиновая кислота," Про — пролин; Вал — валин;
АцОН - уксусная кислота; Бэ - бенЗоил; КБо - карбобвнзокси; ДЦКИ дициклогексилкарбодиимид; ДИФ— диметилформамид; ТЭА — триэтиламин;
ЭА " зтилацетат; ГФХ - хроматография с фильтрованием через гель;
QBT — N- oêñèáåíçoòðèàçoë; Осу
-М-оксисукцинимид; MeOH - метанол;
ПНФ "- паранитрафеноксиу DHA — паранитроанилид; ТБК - трет.-бутилоксикарбанил; ТФУК - трифторуксусная кислота; ТСХ вЂ” хроматография в "îíêîì слое
Типы реакций, применяемых для ските=! а, Для синтеза пептидов (см. таблицу» ХХ «« - ХИП) разные стадии про. водят одинаковым способом, поэтому дано абщ..:; —.. описание реакцйй разных типов и «i таблице указаны промежуточные и †:анечные продукты, методы, примене . :.,:е для реакций разных типов, и н-. которые физические данные.
Ре,:;«.,ц;-:я типа 1. Сочетание хромофорной г. .,ч«пы (. ) .
20 ммалей Ы N-з ащищеннаго аргинина или N"-, Ыщ-эащищеннога орнитина или лизина или соответствующим образам замещеннаго производного пвпти;:;а измельчают, тщательно высушиваю".. и растворяют в 50 мл свежеперегнанной Б,N,N,N,,N",N"-гексаметилфасфорной кислоты при комнатной твмпер:.«туре. Затем при перемешивании в отсутствии влаги добавляют
20 ммолей триэтиламина и 30 ммолей амина, соцержащего хромофорную группу в виде его изоцианатнога проиэвоцного. Смесь выдерживают сутки, реакционный раствор вливают в 0,5 л
2Ъ-ного раствора бикарбоната натрия при первмвшивании, Образовавшийся осадок отфильтровывают и тщательна
55 промывают раствором бикарбоната, водой, 0,5 н. соляной кислотой и снова водой. Из осадка продукт извлекают метанолом, Метанольный экстракт упаривают, остаток перекристаллизовывают или чистят с помощью хроматографии в тонком слое.
Реакция типа 2. Отщепление карбобензокси защитной группы (КБО) .
10 ммолей тщательно высушенного производного карбобензокси (КВО) суспендируют в 25 мл уксусной кислоты и при комнатной температуре в отсутствии влаги добавляют 15 мл
5,6 н.раствора НВг в уксусной кислоте. Через 45-60 мин реакционный раствор по каплям и при энергичном перемешивании вливают в 800 мл безводного эфира. Выпавший осадок атцеляют и промывают 2-3 раза эфиром порциями по 100 мл. Полученный бромгидрат N -деблокированного соедин, нения сушат над таблеткам гидроокио си натрия в вакууме при 40 С в течение 3-16 ч.
Реакция типа 3. Отщегление трет.—
-бутилоксикарбонильной защитной группы (ТБК) .
10 ммолей тщательно высушенного
THK — производного растворяют в
200 мл 25Ъ-ного раствора трифторуксусной кислоты в СН CR в отсутствии влаги при комнатной температуре. Спустя 20 мин раствор по каплям вливают в 500 мл безводного эфи-ра. Выпавший осадок отфильтравывак>т и тщательно промывают эфирам. Полученный трифторацетат N"--деблокированного соединения сушат над таб-летками гидроакиси натрия -" вакууме при 30 С 2"3 ч °
Реакция типа 4.Деблокирование —
-аминогруппы.
При ацилировании производного„получвннагo при реакции т«па 2 или должна.,присутствовать свободная с .-аминогруппа, Деблокирование этой группы осуществляют разными путями, например добавляют один эквивалент. бвзвоцнога третичного амина (триэтиламина или N-этилморфолина) к раствору производного HBr- или трифторуксусной кислоты в диметилформамиде, охлажденному до =10 С, При применении триэтиламина и НВгпроизводных,выпавший в осадок триэтиламин,гидробромиц удаляют фильтрованием. о
Производные с FBr - илн трифторуксусной кислотой можно также растворить в растворе бикарбоната натрия, иэ которого выделяемое производное экстрагируют, например этилацетатом, а затем органическую фазу су-. шйт и упаривают.
700060
Реакция сочетания:
A. С производным N-защищенного эфира °
К раствору 10 ммолвй производного пвптида или аминокислоты, выделенного в 20-50 мл свежеперегнан" ного диметилформамида, добавляют
11 ммолей N -защищенного паранитрофенил- или N-оксисукцинимидоэфирпроизводного аминокислоты при -10 С, о
Смесь выдерживают 1 ч при -10 С, затем добавляют к ней в качестве буфера 5 ммолей третичного амина.
Охлаждение убирают, температура реакционной массы самопроизвольно повышается до комнатной. 3а ходом реакции наблюдают с помощью TCX.
В случав необходимости реакционную массу охлаждают вновь и добавляют 5 ммолей основания. По окончании реакции раствор упаривают при пониженном давлении, полученный маслообразный остаток смешивают с двумя порциями воды и чистят перекристаллизацией или гельфильтрацией. При хроматографии фильтрованием через гель, примененной для очистки продукта, объем элюента полностью или частично совпадает с объемом производного активного эфира сочетаемой аминокислоты. Ilo окончании реакции (перед выпариванием) неизрасходованное производное активного эфира заменяют в течение 30 мин при комнатной температуре избытком (3-5 ммолей) первичного амина, например бутиламина.
Б. С N -защищенной аминокислотой или пептидом. Образование активного эфира по ходу реакции.
К раствору 10 ммолей указанного производного пептида или аминокислоты в 20-50 мл свежеперегнанного димвтилформамида, 11 ммолейй -защи<1, щенной аминокислоты или соответст>>ую>1им образом защищенного производного пептида со свободной С-концевой карбоксильной группой добавляют 11 ммолей К-оксибензотриазола или и -оксисукцинимида при -10 С.
В течение 1-3 ч температуру реакционного раствора (-10 C) повью шают до комнатной. За ходом реакции следят с помоцью хроматографии в тонком слое. По окончании реакции раствор вливают при перемешивании в 100-300 мл 5%-ного водного раствора. бикарбоната натрия.
Полученный осадок отфильтровывают и промывают водой. Затем чистят методом гель-фильтрации или перекристаллизацией.
Реакция типа 5. Отщепление всех защитных групп, очистка и ионный обмен.
0,2 - 1,0 ммоль защищенного производного пептида с хромофорной группой деблокируют обработкой 5-20 мл безводного HF- в присутствии 0,21,0 мл анизола в аппарате Сакакибара,, в течение 60 мин при 0 С. После окончания реакции и отгонки всего
HF- сырой продукт растворяют в 33%ном водном растворе уксусной кислоты и раствор чистят с помощью гель-фильтрации. Продукт сушат лиофилизацией, затем подвергают ионному обмену в колонке, содержащей слабо основную ионообменную смолу.
Сефадекс (Я)С йŠ— 25 в виде хлорида выдерживают до набухания в смеси метанола и воды (95:5). Для растворения и элюирования используют эту же смесь. Чистый продукт сушат при температуре ниже 0 С и пониженном давлении. Полученный продукт растворяют в метаноле и раствор вносят в колонку подходящего размера (объем
0,5 — 7,5 л, длина 100 см), заполненную сефадексом (R) Н вЂ” 20, набухшем в метаноле. Для элюирования используют этот же растворитель.
Элюат разделяют на фракции подходя30 щих объемов и непрерывно определяют их УФ-абсорбцию (254 нм.). Фракции, содержащие продукт, проверяют на чистоту методом ТСХ, чистые фракции объединяют и упаривают.
Производные пептида, полученные после удаления защитных групп с помощью НГ (аналогично реакции типа 5), в виде 30%-ного раствора в водной уксусной кислоте вносят в колонку (объем 0,5 — 2,0 л, длина 30см), заполненную сефадексом (R) G -15, набухшим предварительно в водной уксусной кислоте, продукт элюируют тем же растворителем. Фракции, содержащие продукт (контроль УФабсорбция при 254 нм), объединяют, концентрируют в вакууме на роторном испарителе при 25С С, затем сушат при температуре ниже 0 С.
Хроматография в тонком слое.
Стеклянные пластинки покрывают тонким слоем кизельгеля F (Мерк).
Для проявлечия используют следующие системы растворителей (объемное соотношение): А — бутанол-уксусная
55 кислота - вода (3:2:1); Р— хлороформ — метанол (9:1)) Р )р- хлороформ-метанол (19:1).
По окончании хроматографии пластинку исследуют в УФ-свете (254 нм) и обрызгивают реактивом — хлорортотолуидином.
700060
1 I
I 1
1 I
СО м с
CO
ГЧ с
С) СО
M с
C) Ю м с
CO м с
С) С) Ф с
С) (Ч
1 с
С) Ю
Г
C) »Ф
»й с
С) »
Я
LO с
Ю
»Ч
t-"I
Ю
»3»
ГЧ
Ю с м
M !
Й
»ll
СО
I р
Г» с
»О
СЧ
+ g
Я с3
Гс с сМ мм
+ I
Я (с)
1Р (Ч !
Р
Г с Р
I л
Г л
+ л
Г 4 !
1 о а а
" »») Х
Х m»d
1 1
Х Ф
) Е
Ц
»d (» о х
x M а»d
»») 1 1
Э (-К" и раох
0 g.X к с
»)» Г-» !
» к е
qj :) с
Г 4 е 1
И о
Х tC) tO
Е-» Е-» е х е
I Х
A х о !
Д в х
Г
1 X г4»») хм хи о
1 о а
»»l g
OX о
Х К Д
Х д) 0)
Д 9 с
Е» 1 ш х
»
Д
1 о о
° В "1
Я
1 о . а с» д, о
I I
4»)) ц А А
Ь о4 о
ttI tO R tO
A A t Х
I!
O O
М
Х
Р3
0) о 4
l4 t4
Е»!
» ф х ха о х о,о х ж
Q) Г» а
»х»»
I О с х
\Г
4 х
И ! о
)с
Г» а
»»g
I о а
И
I о
Ш
» а
О а
М
Ф
А<
1 Х ох
ttI A
1 х»4 х о
1 Х а м х
В о о< х ш tt!
Х ЫР
»d Ю »Г У с с м м
» Х х х х
Pc I о
Х
m Ц
6 с
4 Ь
Х Х
Ж Ш -»
VOuu!.u
ОЪ
М л
» »> л л
Ю
% (М л» -»
М
СЧ
° » аА (>
»
Ю
М
Г ) л»
01 а, Ч
» аА
«
СЧ
° »
» >
С>
»п
»!Э
Ю м
М
CD
»>1
Ю
Ю
c3
С1»
П>
Ю
»,1:» >»
С> (3 3»
Ю
» ас>
Ю EC>
» г
СЧ Г сС>, м
»Л»О ! !
»>> л»
0:>
С> аА
Р . ни в м Цн
Х о>
Х Х е е
Г-» Г-» »»3 CP
М
»4 д» Р ь (Ч в х
1 В х
Д о ш о
Х Ш
% в х
М
И о
Я
Х
М в х х
I ж
Ц
Гл
1 о
»»4 A
Ц о
Ю
И х
1
»D л х
Ю (>
CO м
Ю.«э х х м, х х
q
Д
lg»
>; < х х
1 1
1» L
» » а а
1 1
Ф C
»>>
И м ш х, х-, 1 Fl х ф»
»
Ь»4
Й
Г»
» а
1 о а
1:
t
»0
М
1 ь>
1:, (>
I Г4 х,»>, х
I>, I
И
Д U
М
C»l л! .
1 л ч
М
Ц о
CD С и
»»»
Ц
И
-h х в х
И
С»3
»
О
i»C>
Х
«л
»» х
И
1 о
И и
Oi
»
1 о а
»
Д и
1-1
Э х
A и х
»>>
«А нко
oxg
K н
» х
М
1 о я !.»
4; а
g
4 в х
М
Я х
»>, (х
М !
»»4
Q а!
1 а
»>, 1
4 C
А Д
I о<
SQ Д щ. -Х
Х ес| о
»4 а ю
Л
»!»»4 ах
Д Я
/ ! о н L
Х gI
1 с» о и
» а
Ф
О х
° И
I в х
А о
С0
Х
М! х
Ы
» а
3 ех
Ц И
Д
1 о
700060
О\
СЧ л с4 с
ГЧ
I м л с. о м л
1О с л л
Ch о л!
1О с лч
1 щ сй ц1 с с о о ь :Й о (Ч м с о О м с о
«Ф с! с
Ю! с
i«! с
Ю Ф о
"Ф Й с о с
A
I I
Ln
+, с м с
«Ф
1О
I ю
Ю (Ч Ф
1 д, Ю с м
LA
I м м л !
Cl с л!
in !
Ю с л
I н к ц. х . х е е
Гл Гч к х
ГЕ х е е
Гл Г-
)( е .Гч а м ю г о гч ю
ОЭ. Г Г л л ю ю а1
О 9 9
° у «ф ер с с с (Ч (4 4
ilj Ф с м
К !
« о
Й е м
И
9 е.
1 о.
Щ
Ф4 в ж
Д
Р
I о
f1I е х
И
9 х х х с
4 с ° ( х х х б
Я с
Й
Х (1
I с(х
1 Гч
f4 а
4 Я
Ф ((и
9 Ж 9
1- ъ(с! Ц фд
1 и
А4 Рж
1 Га 1 ч
1 П
Х 9 в
I°. а о< аж
1 1 е
l
Г х
)( э( х
4 ж
С4 о
L о
I о
1:»
Г с х л э( х е ф« р« ! (6
Р4
Ь ! о
Г1 у L («
>(« э(3
1 ф с(9 Ol
K c3
1 о
1а
Ж
9 е
g н!
Га!
О 3 с м. !!1 Ln ц 5 о
1 м х
3 м о и
1: о
1 м
Ю с» х э( х и ю
И! Г а 4 а
m 6 е
I а
Гаянэ пм ы,о! ГЧ СЧ ф
Ю и
° Ь
Г
° Й
М
Р1 а, D
Г
700060
О
1О
Ф о
Ц
5)
Ю ж о
>Ъ о
Х Ъ
Ь., о х (б л
Е 0
Ц
Ф ч
Р о
Р3
0 а3
Ю "1 !
LA
С3
3А
i Ф ;;. Фф М"
- ":« ." jap": " Ф: "
15 g.; yg .-. рффи) . изобретения отличающийся тем, Формула
Составитель B. Волкова
Техред Jl, Алферова Корректор Р ° Реиетник
Редактор Т. Загребельная
Заказ 72бО/б2
Тираж 513 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб °, д„4/5!
Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная,4
Способ получения Цептидов общей формулы 1:
D w A — A — A — NHR д Ф где Aq " аланил-, валил-, лейдил-, пропил-, пипеколиновая
-. кислота; аланил-, валил-, глицил-, лейцил-, изолейцил-, фенилаланил-, аэетидинкар" боновая кислота!
A > - аргинил-, лиэил;
R - нитрофенил или их солей, что соединение общей формулы Б И-R, где R имеет указанные значения, подвергают взаимодействию с соответствующей аминокислотой и далее требуемую пептидную структуру постепенно наращивают путем сочетанйя остальных аминокислот, причем R используют в качестве защитной группы для С-концевого карбоксила ц первой аминокислоты, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Шредер Э., Любке К. Пептиды, ч. 1. - Москва: Мир, 1967, с. 11б.
