Реактив для определения общего холестерина в сыворотке крови

 

Союз Советских

Сощиалистическик

Реслублик

1 (51) М. Кл.

А 61 В 10/00

G 01 N 33/16 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 071074(2I) 2012029/

/2064837/28-13 (2З) Прноритет28.0374(32) 28. 03, 73

Государственный комитет

СССР но делам изобретений н открытий (84)Р 2315501,3 (ЗЗ) ФРГ (53) УЛК 616-074 (088. 8) Опубликовано 250280. Бюллетень Уй 7

Лата опубликования оннсання2Ь02.80 (72) Автори изобретения

Иностранцы

Клаус Бойкамп, Ханс Меллеринг, Гюнтер Ланг, Вольфганг

Грубер и Петер Решлау (ФРГ) Иностранная фирма Берингер Маннхайм ГмбХ (ФРГ) P3) Заявитель (54) РЕАКТИВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО ХОЛЕСТЕРИНА

В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Холестеринэстераза

Холестериноксидаза

Каталаза

Ацетилацетон

Метанол

0,05 10 -6 10

0 1 ° 10 3 -6.10 3

0,4 10 -10 10

5* 10 -0,2

2,0-10, 0

Изобретение относится к области медицины и может быть использованО при диагностике различных заболеваний.

Известен реактив для определения общего холестерина, состоящий из алкоголь-эфирной смеси, дигидонина, хлороформа, уксусного ангидрида и серной кислоты, взятых в определен= ных количествах (1), Однако известный реактив не позволяет точно определить общий холестерин в сыворотке крови.

Целью изобретения является повышение точности определения.

Это достигается тем, что реактив содержит холестеринэстеразу, холестериноксидазу, каталазу, ацетилацетон, метанол, детергент и аммиачный буфер при следующем соотношении компонентов, вес.Ъ: и

Детергент 2,0 10 -1,01

Аммиачный буФер Остальное

Для реактива можно применять выделенную и обогащенную холестеринэстеразу, предпочтительно иэ микроорганизмов. Обогащение достигают путем диализа, обработки слабо-основным анионитом и фракционирования суль® фатом аммония из сухого порошка из ацетона микроорганизма или другого биологического материала. Таким образом достигают 20-30-кратное обогащение холестеринэстеразы.

® В качестве слабо-основного .анионита пригодным является модифицированный диэтиламиноэтанольными группамк препарат на о"нове углеводов.

При Фракционировании сульфатом аммония получают предпочтительно фракцию .между 1,8 и 2,4 моля сульфата аммония. Полученную фракцию фермента затем хроматографируют.

Хорошие результаты получают, когда микроорганизмы вырашивают в питательной среде, содержащей сложные эфиры холестерина. При этом сложные эйиры.холестерина или смесь эфиров можно добавлять во время выращивания в © качестве источника углерода или мож- .717994

0,1-1,0 ед

l3-150 ед./мг но применять вместе с другими источниками углевода. Особенно предпочтительно применение микроорганизмов, которые получают по многостадийному I способу выращивания, причем выращивание в первой стадии пооизводят на пригодных источниках углерода (глицерин) и во второй стадии — на сложных эфирах холестерина.

Применение холестеринэстеразы из

Сапй1йа rugosa M4СС 14830 в слабо кислой форме, рИ 5-6 5 показывает высокую стабильность. Оптимальное рН Фермента 7,5. Активность холестеринэстеразы повьааается путем добавки поверхностно-активных веществ.

Особенно предпочтительна добавка

"гидроксиполиэтоксидодекана.

Определение холестерина проис ходит ферментацией при применении холестериноксидазы, но можно также 20 применять холестериндегидразу или холестериндегидрогенаэу..

Ферментативное определение общего или связанного холестерина осуществляют с помощью холестериноксидазы, предпочтительно применяют холестериноксидазу из Nocardia

erythropoK1s ANCC 17895, ИосагЖа

erythropo8is AMCC 4277,Nocardia

formica AMCC 14811 или Proactinomyces Зп

erQthropo6is 1В 9158.

Предпочтительным реактивом является реактив, состоящий из холесте "риноксидазы, препарата холестеринэстеразы из микроорганизмов, каталазы, ацетилацетона, метанола и содержащего ионы аммония буфера, взятых по отдельности или в смеси.

Реактив также может состоять иэ холестериноксидазы, препарата из микроорганизмов с активностью холестеринэстеразы, пероксидаэы, хромогена и буфера в отдельности или в смеси. В качестве хромоъ.ена используют 2,2 -аминобензтиазолинсульфоf -;кислоту. . 45

Реактив также может состоять из холестериноксидазы, препарата холестеринэстеразы и производного гидразина, реаги) ующего с кетогруппами щ с образованием гидразона, а такЖе буфера. В качестве проиэводноГо гидразина используют 2,4-динитрофенилги11раэин.

Кроме того, реактив может дополнительно содержать растворители, стабилизаторы и поверхностно-активные вещества.

Предпочтительно реактивы содержат следующие компоненты:

1, Холестерин- 60 оксидаза

Холестеринэстераза из микроорганизма . 0,05-0,5 мг . 65

Каталаза 2 10 -5 10 саед.

Ацетилацетона 0,05-0,2 мл

Метанол 2-10 мл в 100 мл буфена,содержащего ионы аммония, рН 5-7.

Гидроксиполизтоксидодекан 0,02-0,3 мл

2.Холестеринок .идаза 3-40 ед./мг

Холестеринэстераза иэ микроорганизма 0,05 0 5 мг

Пероксидаза . 2 ° 10 -1 104

2,2 -Аминобензтиазолинсульфокислота 50-200 мг

Гидроксиполиэтоксидодекан 0,05 — 0,5 мл в 100 мл буфера с рН 6-8

3.Холестерин-: оксидаза

Холестеринэстераза из микроорганизма 0,05-0.,5 мг

1 мм раствор

2,4-динитрофенилгидразина 1-5 мл

ПАВ 0,005-0,1 мл в 10 мп буфера с рН 6-8.

4.Холестериноксидаза 2-100 ед.

Холестеринзстераза из микроорганизма 0,05-0,5 мг

ПАВ (гидрокси полиэтоксидодекан) О, 1-2,0 мл в 50 мл буфера с рН 5-9.

С помощью предложенного реактива можно осуществлять быстрое и полное омыление связанного холестерина. Например, при условиях определения холестерина с помощью холестериноксидазы достигают количественное расщепление связанного холестерина в течение 1-3 мин при добавке сухого порошка из ацетона Candida rugosa

АИСС 14830 или Aspergi &us spec. WS

90030 в количестве 0,1-0,3 мг.

Пример 1. В сыворотке крови определяют содержание свободного холестерина до 63% (63 мг в 100 мл) .Для определения связанного холестерина сравнительную пробу сыворотки крови обрабатывают в течение 30 мин спиртовым раствором едкого. кали при 70 С.

После нейтрализации и нового измерения имеющегося холестерина получают общее содержание холестерина 181 мгВ.

Получается, что 118 мг холестерина/

100 хп находятся в связанной форме.

Способ с необработанной сывороткой повторяют, но в начале определения добавляют 0,3 мг (по отношению к протеину) сухого порошка из ацетона

Candida rugosa ANCC 14830 в стандартной форме. Через 3 мин полярографи717994

65 ческое определение дает содержание общего холестерина 183 мг Ъ.

Пример 2. Для повьыения активности сложных эфиров холестерина стандартный сухой порошок из ацетона Candida rugosa ANCC 14830 растворяют в буфере из фосфата калия с рН 6,0 и диалиэуют по отношению к такому же буферу. После удаления лактозы, содержащейся в качестве стабилизатора, получают удельную активность холестеринэстеразы

0,3 ед./мг протеина в диализованном растворе.

Полученный раствор смешивают с ионитом на основе декстрана, моДифицированным диэтиламиноэтанольными группами, ионообменник отделяют и элюируют 0,2 М фосфатным буфером с рН 6,0. В элюате получают удельную активность холестеринэстеразы

1,2 ед./мг.

Полученный раствор подвергают фракционированию сульфатом аммония.

Выпавшую между 1,8 и 2,4 М сульфата аммония протеиновую фракцию отделяют. Она показывает удельную активность холестеринэстеразы 2,5 ед./мг.

Полученный продукт снова растворяют в фосфатном буфере с рН 6,0, диализуют по отношению к такому же буферу вплоть до обесооливаниЯ и затем хроматографируют через колонну, которая заполнена таким же анионитом, как указано выше. Опять проводят элюирование с помощью 0,2 М фосфатного буфера с рН 6,0, Во фракции удельная активность холестерин-. эстеразы достигает 7 ед../мг протеина, Полученный обогащенный препарат холестеринэстеразы применяют для определения холестерина, как описано в примере 1. Примененное колИчество составляет лишь 0,001 мг по отношению к протеину. Результаты соответствуют результату примера 1, Холестеринэстеразу из Candida

rugosa можно очистить обычным способом тонкослойиой хроматографией.

Вместо стадий обогащения можно Применить биохимические стадии очистки, например, осаждение или фракционирование с помощью полиэтиленимина, ор» ганических растворителей или солей, хроматографии через материалы молекулярных сит или более слабые анионообменники с другими функциональиымй группами, чем диэтиламиноэтанольные . группы, осаждение с помощью протаминсульфата.

Пример 3. К 0,5 мл сыворот)ки крови или стандартному холестерину добавляют 1,0 мл 0,5 М буфера на основе фосфата калия с рН 7,5, котбрый содержит 0,4% гидроксиполиэтоксидодекана и 2,5 ед./мг холестеринэстеразы, согласно примеру 2.

Эту реакционную смесь инкубируют в течение 40 мин при 37 С. Затем

0,25 мп этого раствора добавляют к

3 мл реактива на холестерин, который содержит две части уксусной кислоты, три асти уксусного ангидрида и одну часть серной кислоты (реактив Либермана-Бурхардта) °

При использовании стандарта в качестве относительной величины для ти« пичной пробы найдено 170 мг Ъ общего холестерина. Сравнительное определение при омылении сложных эфиров холестерина спиртовым раствором едкого кали дает 165 мг 3.

Пример 4, 0,02 мл сыворотки крови смешивают с 10 мл 0,5 М буфера на основе фосфата калия, который содержит 0,4% гидроксиполиэтоксидодекана и 0,2 ед/мг холестеринэстеразы, по примеру 2.

Реакционный раствор инкубируют

60 мин при 37 С. Затем высчитывают

20 экстинкцию (E ) при 240 нм в пригодном спектрофотометре и реакция начи- нается с помощью 0,1 ед/мг стериндегидразы из Brevibacterium stегоlicum.

Через 1.5 мин снова определяют экстин25 кцию Е . Концентрация образовавшегося z< -холестенона и вместе с этим холестерина получается из разницы между первым и вторым определением с учетом молярного коэффициента

30 экстинкции для ь4 -холестенона при 240 нм. Измерение типичного образца дает 183 мг Ъ общего холестерина. Сравнительное определение с помощью холестериноксидазы (иэ

Nocardia erythropo(.is) вместо стеЗ5 риндегидразы дает 181 мг % общего холестерина.

П р и M е р 5. 10 г диаммонийгидрофосфата растворяют в 100 мл воды и с помощью 85%-ной фосфор,4О ной кислоты устанавливают рН 7,0.

Затем добавляют 10 ед./мг каталазы.

С помощью полученного раствора смесь из 0,2 мл ацетилацетона, 10 мп метанола и 0,1 г гидроксиполиэтоксидо45 декана доводят до 100 мп. К этому раствору добавляют 2,5 ед./мг холестеринэстераэы из Rhizopus spec. (WG 90027),. 5 мл полученного раствора смешивают с 0,02 мл сыворотки или 0,02 мл стандартного раствора

5О холестерина с содержанием 200 мг В холестерина. Аликвотные части об-. разца, содержащего сыворотку и также стандарт холестерина, смешивают, с 0,1 ед/мг холестериноксидазы и инкубируют 60 мин при 37 С. Затем полученный краситель измеряют фотометрически при 405 нм с учетом значений контрольных образцов.

Содержание холестерина в содержаrrg щем сыворотку образце составляет при использовании стандарта в качестве относительной величины 154 мг В общего холестерина. Контрольное оггределение с помощью холестеринэстеразы из Candida rugosa AMCC 14830 вместо холестеринэстеразы из Rhido717994

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Техред Н.Ковалева Корректор И.Муска

Редактор В. Бер

Заказ 9863/70

Тираж 673 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,4

pus spec. (WS 90027) дает такое же значение.

Предлагаемый реактив повьааает точность определения общего колестерина в сыворотке крови.

Реактив для определения общего холестерина в сыворотке крови, о т л и- 0 ч а ю шийся тем, что, с целью повыаения точности определения, он содержит холестеринзстеразу, холестериноксидазу, каталазу, ацетилацетон, метанол, детергент и аммиачный 15 буфер при следующем соотношении компонентов, вес.Ъ:

Холестеринзстераза 0,05 ° 10 -6 ° 10

Холестериноксидаза 0,1 ° 10 -6 *10

Каталаза 0,4 ° 10 -10 ° 10

Ацетилацетон 5 10- - 0,2

Метанол 2,0-10,0

Детергент 2,0 10 -1,01

Аммиачный буфер Остальное

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Предтеченский В. Руководство по клиническим лабораторным ис-. следованиям. М., 1964, с. 223-224.