Способ получения вакцины против гепатита в
@, яуот п,72872О
Союз Соаетсккз
Соцкалмстическкх
Республик (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 120376 (21) 2332953/28-13 (23) Приоритет — (32) 17. 11. 75 (51) М. Кл.
С 12 К 5/00
Государственный комитет
СССР по делам изобретений и открытий (З) США (31) 631961 (53) УДК 615 ..372 (088. 8) Опубликовано 150480. Бюллетень № 14
Дата опубликования описания 150480 (72) Авторы изобретения
Иностранцы
Альфред МайеР ПРинс, Александер Роберт Ньюрат (США), Джон Внек (ЧССР) и Кристиан Трепо (Франция) Иностранная фирма
1 1
Дзе Коммьюнити Блад Каунсил оф Грейтер Нью-йорк, Инк (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В
15
30
Изобретение относится к медицинской промышленности и касается производства бактерийных препаратов.
Известен способ получения вакцины против гепатита В путем выделения частиц HBsAg, содержащих е-антиген на частицах или в растворе, из плазмы крови носителей антигена гепатита В, содержащей е-антиген с последующей инактивацией целевого продукта (1) . Однако вакцина, полученная . известным способом, не обладает высокой специфичностью.
Целью изобретения является повышение специфичности вакцины.
Эта цель достигается тем, что плазму крови обрабатывают 3,04,5 вес.Ъ полиэтиленгликоля при РН
4,4-4,7, полученный осадок, содержащий HBsAg частицы размером 30-50 нм, растворяют при РН 4,9-5,1, затем
РН надосадочной жидкости доводят до 4,4-4,7, повторно обрабатывают полиэтиленгликолем и полученный осадок растворяют в физиологическом растворе.
Кроме того, целевой продукт инактивируют обработкой формалином или р -пропиолактоном или облучением рентгеновскими лучами.
Предлагаемым способом получают вакцину против вирусного гепатита, которая включает в свой состав антигенные частицы, имеющие размер частиц 20-50 нм, причем эти антигенные частицы содержат неосажденные свободные необъединенные гепатит р-поверхностные антигены. Вакцина имеет менее 10 единиц антител гепатит Р --поверхностного антигена на 1000 ед. гепатит -поверхностного антигена. 5Ъ частиц с размером, лежащим в интервале 3-50 нм, содержат неосажденные е-антигены или специфичные антигены, аналогичные частицы Дана. Антиген гепатита и е-антиген содержатся в вакцине в количестве, достаточном цля образования антител при введении нх в организм животного.
Для получения вакцины против гепатита В используют материал, состоящий из плазмы, полученной из хронического носителя, который содержит антигены. Такая плазма также содержит большое количество частиц Дана и волокон, не содержащих объединенного анти-е-антитела. Плазма может быть получена от клинически здоровых человеческих хронических носителей нВ, а также от шимпанзе, которых
728720 естественно или искусственно инфицировали вирусом HB и которые становились хроническими носителями е-антиген положительногo HBsAg.
Исходный материал должен быть бактериологически стерильным и должен быть свободным от присутствия адвентициальных вирусов.
Очистку проводят обычным способом.
Из антигенсодержащего вещества крови удаляют примеси путем подкисления до рН 4,4-4,7. Выпавший осадок вместе с клеточными остатками удаляют центрифугиронанием в течение
20 мин со скоростью 10000 об/мин.
После этого материал смешивают с
2,5-4,5 вес.Ъ полиэтиленгликоля, !
5 предпочтительно с 3,0-4,5 вес.Ъ. Более ни з кие концентрации, например
3-4Ъ, могут осаждать крупные формы частиц и поэтому при определенных обстоятельствах являются предпочти- 20 тельными. Весовой процент полиэтиленгликоля рассчитывают по отношению к общему весу смеси. Таким образом, осаждают антигенный материал, содержащий гепатит В с более крупным 25 размером частиц, например 30-50 нм, а также часть материала, содержащего оболочкоподобный гепатитный В поверхностный антиген. Осадок, содержащий
HBsAg, регенерируют, и добавляют некоторое количество воды при рН 4,9—
5,1. Образуется осадок, содержащий белковое вещество и полиэтиленгликоль, а жичкая фаза — надосадочная жидкость, содержащая HBsAg, содержит частицы Дана или волокнистое вещество, рН недостаточной жидкости доводят до 4,4-4,7. Затем ее смешивают с 3,0-4,5 нес.Ъ полиэтиленгликоля, считая на общий вес смеси, с образованием осадка, содержащего очищен- 40 ные частицы, содержащие HBsAg поверхностный антиген, имеющие оболочкооб.разную конфигурацию с размером частиц 20-30 нм и волокнистые частицы, содержащие HBsAg e-антиген, который не содержит какого-либо анти-е-антитела, причем волокнистые части— цы имеют диаметр 20-50 нм, а также частицы Дана со сферической конфигурацией, имеющие размер 40-50 нм и 50 имеющие липопротеиноную внешнюю сферу, содержащую HBsAg и е-антигены, а также содержащие сердцевину, включающую ДНК, ДНК полимеразу и HBsAg.
В результате регенерируют очищенный антигенный материал. После этого его обрабатывают с целью инактинации вируса, а полученный осадок растворяют в физиологическом растворе.
Температура каждой из смеси после Я каждой стадии смешивания поддержинают в интервале 0-80 С в ходе образоЯ вания осадков. Стадия очистки облегчается, если регенерацию усиливают в результате центрифугиронания с 65 последующими стадиями осаждения.
Полиэтиленгликоль используют н виде водного раствора, который содержит
30 вес.Ъ полиэтиленгликоля. Такой полиэтиленгликоль имеет мол. вес.
500-50000, предпочтительно около 6000.
Дальнейшую очистку осуществляют путем адсорбции очищенных антигенов на гидроксилаппатите с использованием хроматографии. Частично очищенные антигены пропускают через хроматографическую колонку, содержащую гидроксилапатит, на котором они адсорбируются. Дополнительно очищенные антигены затем регенерируют с использованием мчогоступенчатого элюирования. Частицы с размером 2550 нм регенерируются отдельно от фракций с частицами более мелкого размера (16-22 нм) и от основной массы сывороточных протеинов. После очистки фракция более крупных частиц может быть инфекционной. Для этого осуществляют инактивацию. Целевой продукт инактинируют обработкой формалином в концентрации 1:2000 в течение 4 дней при 37 С с использованием обычных методик или облучением рентгеновскими лучами. Вакцину осветляют путем фильтрации через
MiIIipore 0,22, фильтр или эквивалентный фильтр перед добавлением формалина или PJ -пропиолактона.
После инактивации конечный продукт подвергают диафильтрации с использованием Amicon РПЗО фильтра или эквивалентного фильтра против
0,9Ъ NaCI, содержащей 1:10000 ThiomerasaI и любой стабилизатор, для удаления низкомолекулярных соедине- ний, используемых для инактинации, затем стерильно фильтруют и соответствующим образом разливают в стерильные ампулы для модификации или замораживания, Вакцину используют на отсу".ствие инфекциозности, иммунологическую активность.
Вакцину можно применять путем подкожной или ннутримышечной инъекции. Применяют обычно около днух доз в месяц с последующим введением вспомогательного вещества н период от 6 мес. до 1 года после перничной иммунизации. Первоначальная дозировка зависит от веса организма, а последующие дозировки — в зависимости от уровня антител в крови после первоначальной иммунизации.
Использование получаемой вакцины против гепатита В предотвращает хроническое заболевание печени.
Пример 1. Очистка и определение НВ ассоциированных частиц из
7,8 л плазмы от одного шимпанзе-носителя HBsAg.
Вещества и методики. Источник
HBsAg.
Антиген очищают из объединенной плазмы носителя шимпанзе, преднари728720 тельно инокулирэванйого человеческой
HBsAg — положительной.плазмой, относящейся к adn подтипу. е-Антиген присутствует на поверхности способных к идентификации частиц Дана и используемой плазме.
Очистка HBsAg и е-антигена.
HBsAg и е-антиген выделяют из плазмы путем осаждения с помощью полиэтиленгликоля (PEG). Повторно суспендированный осадок HBsAg и е-антигена очищают хроматографированием на колонке с гидроксилапатитом. Конечные стадии очистки включают плотностное градиентное центрифугирование.
Осаждение HBsAg и е-антигена с помощью PEG.
На стадии, предшествующей очистке 7,800 мп HBsAg и на содержащей е-антигена плазмы, устанавливают рН 4,6 и добавляют ЗОЪ-ный раствор 2()
PEG в дистиллированной. воде до приблизительно 2Ъ концентрации. Раствор оставляют на ночь при 4 С и осветляют центрифугированием HBsAg во всплывшем слое, осаждают увеличением концентрации PEG до 4Ъ. Всплывший слой после стояния в течение ночи при 4 С декантируют и отбрасывают. Осадок
HBsAg (содержащий е- антиген) ресуспендируют до 500 мл в дистиллированной воде. Основную часть PEG с некоторыми примесями осаждают, устанавливая рН раствора равным 5,0 и осадок удаляют центрифугированием. Прозрачный верхний слой доводят до рН 4,6 и HBsAg и ассоциированный с частицей е-А HBsAg (e) осаждают в результате добавления ЗОЪ раствора
PEG до конечной концентрации 4Ъ.
HBsAg/е удаляют центрифугированием после стояния образца в течение но- 40 чи при 4 С. Наконец, осадок HBsAg/е о ресуспендируют до 320 мл в дистиллированной воде.
Хроматографирование на колонке с гидроксилапатитом. 44
50 мл ресуспендированного .PEG осадка HBsAg/å пропускают через колонку 6,5 X 16,5 с гидроксилапатитом и элюируют прерывистым градиентом фосфатного буфера. В следующем экс- 5{) перименте 200 мл образца подвергают частичной очистке на колонке
6,5 X 35 см с гидроксилапатитом.
HBsAg, элюированный совместно с первым протеиновым пиком, пропускают
55 через колонку с гидроксилапатитом во второй раз.
Плотностное градиентное центрифугирование.
Фракции HBsAg, выделенные хроматографированием на колонке, очищают 40 скоростным зональным центрифугированием. Прерывистый градиент получают при использовании 3 мл 60 Ъ и 7 мл
40Ъ сахарозы в 0,02 М натрийфосфатном буфере при рН 7,2 (содержащем
0,02Ъ NaHq) .
В каждую пробирку загружают по
20 мл образца и центрируют на Spinso
SW 25,1 роторе при 18000 об/мин в течениЕ. 18 ч.Фракции объемом 1!мл собирают по каплям со дна пробирок и анализируют на содержание НВздд, Фракции, содержащие максимальное количество антигенной активности, объединяют, тщательно диализируют и концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембраны с 30000 MW отжимным рантом (Амикон РМ-30) . -.Концентрированные фракции HBsAg подвергают конечным стадиям очистки изопикническим связыванием в линейном градиенте CsCI и скоростному зональному центрифугированию в прерывисТоМ градиенте сахарозы при обычно используемых условиях.
Методы детектирования.
3а содержанием HBsAg следят методом встречного электрофореза (CEP) или твердо-фазной радиоиммунопробой
Ausria 1 или II, Abbott Laboratories
Концентрацию протеина устанавливают при 280 нм с использованием микрометодики KjehIdahI
Критерий чистоты HBsAg.
Образцы после каждой стадии очистки анализируют методами целлюлозоацетатного электрофореза, иммуноэлектрофореза и испытаниями диффузии в системе агарового геля по отноше— нию к поливалентной аытинормальной человеческой плазмапротеиновой антисыворотке.
Полиакриламидный гелевый электрофорез.
Аликвоты образцов, содержащие
0,01 натрий фосфатный буфер при рН 7,2, 1Ъ натрий додецилсульфата, 1Ъ -меркаптоэтанола и 10Ъ глицерина, нагревают в течение 2 мин на кипящей водяной бане, обрабатывают 7,510Ъ найтрийдодецилсульфатакриламидными гелями.
Результаты очистки HBsAg/е положительных сывороток осаждением с помощью полиэтиленгликоля представлены в таблице. Около 87Ъ первоначального протеина плазмы удаляются на первой стадии осаждения HBsAg (которая включает предочистку при концентрации
PEG 2Ъ) . Конечный выход после двух последовательных стадий осаждения с помощью PEG лрказывает количественную регенерацию HBsAg в присутствии лишь
4Ъ первоначальных протеинов.
Очистка объединенного HBsAg шимпанзе осаждением с помощью PEG-6000.
728720
Образец
Ь и
Первоначальная
HBsAg-плазма
100
7,800 512
429,0
Первое осаждение
4% PEG
6,9
55,0
7,080
500
20 7
16 6 80
Второе осаждение
4% PEG 320 10 000
50 мл ресуспендированного PEG осадка НВэАу фракционируют хроматографированием на гидроксилапатите.
Элюат группируют на семь фракций, которые диализируют по сравнению с 0,02 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,2 (содержащим 0,02% азица.натрия) и концентрируют ультрафилы- 2О рацией. Концентрированные образцы анализируют на протеины при 280 нм и на присутствие HBsAg методом CEP.
200 мл ресуспендированного PEG осадка HBsAg Фракционируют на 1000 мл колонке с гидроксилапатитом. Фракции HBsAg из первого протеинового пика (группа 1: фракции 38-83) и оставшийся элюат (группа II фракции
84-110) объединяют и концентрируют до 75 мл ультрафильтрацией.
Концентрированный образец из группы 1 повторно хроматографируют на колонк объемом 1000 мл с гидроксилапатитом.
Элюат объединяют на восемь фракций. Объединенные образцы концентрируют ультрафильтрацией и промывают
0,02 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,2 (содержащим 0,02% азида натрия) . Эти образцы анализируют на 40 протеин и HBsAG.
Анализ образцов на содержание примесей методом иммуноэлектрофореза обнаружил очень слабую линию преципитации во фракции I, более сильную линию во фракции ll — Vl и сильно выраженную широкую линию в объединенных фракциях Vl(-ЧИ), которые мигрируют между альфа и альбуминной областями °
Электронн ая микроскопия образцов обнаружила в основном сферические частицы с диаметром 22-28 нм во фракциях 1 — ill сферические частицы и волокна, но фракциях lV -Ql, гла.вным образом небольшие сферические ча стицы и некоторое количество волокон но фракциях Vll ч Vill
Концентрированные образцы из предыдущих стадий подвергали полной очистке плотностным градиентным цент- Щ рифугиронанием.
Очищенные препараты HBsAg, состоящие главным образом из сферических частиц диаметром 20-22 нм, сферических частиц диаметром 22-28 нм, волокон различного размера и частиц
Дана, содержащих по 100 мг протеина, анализируют на полипептидный состав полиакриламид гелевым электрофорезом.
Количественную разницу наблюдают н протеиновых пиках индивидуальных образцов.
° Пики карбогидратов низкого молекулярного веса представляют собой гликолипиды, поскольку они не проявляются при голубом окрашивании по
Coomassie.
Вакцину готовят иэ фракций крупных частиц, полученных в результате добавления человеческого сывороточного альбумина с концентрацией
0,5 мг/мл с последующей инактинацией по сериям облучением от кобальтового источника (2,5 миллиона рад) инактивацией формалином с использованием общепринятых методик (37 С, 96 ч, концентрация 1:2,000), с последующим использованием Р-пропиолактона по методикам, обычно используемым при производстве вакцин против бешенства.
Пример 2. Модифицированная .усонершенствованная PEG методика для выделения HBsAg/е.
Модифицированную методику для осаждения PEG используют на 2,6 л смешанной НВэА9, содержащей плазмы от одного шимпанзе-носителя, содержащего е-антиген н необъединенном, неосажденном виде. рН плазмы устанавливают равным приблизительно 4,6 и немедленно добавляют 30%-ный раствор PEG до конечной концентрации 2%.
Раствор вымораживают на льду н течение 30 мин (вместо стояния в течение ночи при 4 С, как в предыдущем примере) и осадок удаляют центриФугированием.
Во всплывшем слое, содержащем
HBsAg, устанавливают концентрацйю
PEG, равную 4% (нместо 4,5% н предыдущем примере) в результате добавления б,б ч на 100 30%-ного раствора
PEG при комнатной температуре. Суспензию снова вымораживают на льду в течение 30 мин и осажденный
HBsAg/е удаляют центрифугиронанием.
Осадок ресуспендируют до 200 мл в дистиллированной воде. Основную часть
PEG и сопутствующих примес и ) д ляю
< ? 87?О
10 путем установления рН, равным 5, 0, вымаааживанием раствора на льду в течение 30 мин и удалением полученного в результате осадка центрифугираванием. рН прозрачного всплывшего слоя иэ предыдущей стадии вновь устанавливают равным 4,6 и добавляют 30%
PEG да конечной концентрации порядка 3% (вместо 4,.0-4,5%, как зта целали pa«ee). Вещество вновь вымаракивают на льду в течение 30 мин и асацак HB sAg /e aësr