Кюветная камера для определения аденазинтрифосфата

 

( о и и с-А-н

ИЗОБРЕТЕН

Союз Советскик

Сощиапистическин республик 728782 (61) Дополнительное к авт. свил-ву (22) Заявлено 05.08.78 (21) 2660108/30-15

Pl)M. Кл. с присоелинением заявки ¹â€”

А 01 G 7/00

С 01 Ю 1/30

Государственный кемнтет (23) Приоритет

Опубликовано 25„04.80. Ь1оллетень ¹15 пв делец изобретений н птирыткй (53) УДК542.242. .2(088.8) Дата опубликования описания 28.04.80 (72) Авторы изобретения

В. Е. Ерохин и A. П. Гордиенко (7() Заявитель (54) КЮВЕТНАЯ КАМЕРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕН ИЯ

АДЕНАЗИНТРИФОСФАТА

Изобретение относится к технике измерения слабых свечений при биолюминесцентных реакциях, и именно к устройствам кюветных камер для биолюминесцентного измерения количества аденазинтрифосфата (АТФ) цо его реакции с люциферин-люци5 феразным фермент-субстратным комплексом из светоносных органов светляков 1сЛо g eic .

Известна кюветная камера для опреде30 ления АТФ, содержащая установленный на опоре светонепроницаемый корпус, в котором находится фотодетектор с рабочим окном и кювета для введения реагентов. Фотодетектор отделен от кюветы с помощью фотозатвора Ц, Однако в таком устройстве при зацолнении кюветы фермент-субстратным комплексом люпиферин-люциферазы вне светонепроницаемой камеры возникает значительная нестабильная ошибка за счет паразитной затухающей люминесценции стекла кю,веты, возбуждаемой при проведении манипуляций с кюветой на свету. Кроме того, 2 наличие фотозатвора обуславливает необходимость применения блокировочных устройств для зашиты фотодетектора, в результате чего усложняется аксплуатация кюветной камеры. Например, при проведении одного измерения необходимо минимум два раза вынуть кювету из камеры и выполнить шесть операций по открытию и закрытию фотозатвора, Удаленность кюветы от фотодетектора ведет к потерям за счет рассеяния света.

Известна также конструкция кюветной камеры для биолюминесцентного определения.аденазинтрифосфата, содержащая установленный на опоре светонепроницаемый корпус, в котором размещен фотодетектор с рабочим окном и кювета с сифоном для введения в нее реагентов, причем кювета отделена от фотодетектора с помощью фотозатвора (2) .

Такая конструкция кюветной камеры имеет те же недостатки, кроме того, используемый способ перемешивания реагентов не всегда обеспечивает реакцию до7287

3 статочным количеством кислорода, поскольку перемешивание реагентов в кювете осуществляется за счет впрыскивания через сифон исследуемого раствора ЛТФ в одре деленный обьем фермент-субстрвтного комплекса, что отражается на результатах измерения, так как реакция лимитируется по кислороду.

Йель изобретения — улучшение эксплуатационных характеристик кюветной ка- to меры, повышение точности измерения и устранение паразитной люминесценции, Это достигается тем, что кювета установлена непосредственно на рабочем окне фотодетектора и между кюветой и фотодетектором размещен слой оптической смазки, причем кювета снабжена дополнительным сифоном и связанной.с ним системой вакуумного отсоса и продувки реагентов газами, а светонепроницаемый корпус кюветной камеры установлен на опоре шарнирно.

На фиг, 1 схематически изображена предлагаемая кюветнвя камера, продольный разрез; на фиг; 2 — сечение А-А, на фиг„1 (сечение по шарнирному соединению корпуса кюветной камеры с опорой).

Предлагаемая кюветная камера содержит светонепроницаемый корпус 1, и кото- ЗО рый заключена кювета 2 для реагентов с зеркальным отражающим покрытием ее боковой внешней поверхности, установленная непосредственно на рабочем окне 3 фотодетектора (фотоумножителя) 4. Оптическая связь кюветы 2 и фотодетектора

4 осуществляется через слой оптической смазки 5 (например,селиконового масла).

Механическое крепление кюветы 2 к фо.тодетектору 4 обеспечивается оправой 6, 40 например, из пластмассы. Для введения реагентов и промывочных растворов в кн вету 2 служит сифон 7, а для отсоса отработанных реагентов и промывочных раст. воров кювета 2 снабжена дополнительным сифоном 8, который сообщен через трехходовой кран 9, магистраль 10 и перепускную емкость 11 с вакуумом, например, водоструйным насосом (на черт. не показан). Для перемешивания реагентов и обо- гашения их кислородом (газами), осуществпяемого путем продувки кислорода (газов) через сифон 8, последний также через ходовой кран 9 соединен с магистралью 12, обеспечивающей подачу кислорода (газов) в сифон 8. Кюветная камера имеет вертикальное рабочее положение и закреплена на штативе с помощью шарни92

4 ра 13 с фиксатором (на черт, не показан) для отклонения кюветной камеры от рабочего положения. Это значительно облегчает и ускоряет отсос отработанных реагентов и промывочных растворов из кюветы.

Измерения в предлагаемой кюветной камере осуществляют следующим образом.

После проведения темнового тока фотодетектора 4- в кювету 2 через входной сифон 7 впрыскивают с помощью шпридадозатора (на черт, не показан) определенный обьем фермент-субстратного комплекса люциферин-люциферазы и измеряют уровень свечения (фоновое высвечивание) .

Затем в кювету 2 через сифон 7 вводят также с помощью шприца-дозатора исследуемый раствор с АТФ. Одновременно включают блок регистрации свечения с отметчиком времени и подачу кислорода (газов) через дополнительный сифон 8 для обогащения кислородом (газами) и перемешивания реагентов. Через 10 сек подачу кислорода (газов) отключают перекрытием трехходового крана 9, после чего реа кция свечения стабилизируется в течение 20 сек. Затем проводят регистрацию свечения в течечие 60 сек. Снятие показаний осуществляется автоматически через равные интервалы времени (например, через 10 сек) на цифропечать. По окончании измегений с помощью трехходового крана 9 подключают отсос воздуха для создания в перепускной емкости 11 вакуума и отработанные реагенты поступают .в перепускную емкость 11. Затем через сифон 7 вводят промывочный раствор и одновременно отсасывают его в перепускную емкость 11. Полный отсос промывочного раствора из кюветы 2 производят о наклоном кюветной камеры на 25-30 С от вертикального (рабочего) положения вокруг шарнира 13. Степень промывки кюветы 2 контролируют по величине темпового тока фотодетектора 4. По окончании промывки отсос воздуха отключают, а кюветную камеру возвращают в исходное положение. После этого она готова к новому циклу измерений. Длительность обработки одной пробы,составляет5-6 мин.

Испытания кюветной камеры показали, что при использовании неочищенного комплекса люциферин щоциферазы можно уве-4О ренно определить до 10 r АТФ в 1 мл пробы, тогда как в кюветной камере по

=g прототипу определяется до 10 АТФ.

Затраты времени на одно определение снижаются более чем в два раза.

Кюветная камера для определения аде- 0 назинтрифосфата, содержащая установленный на опоре светонепроницаемый корпус, в котором размещен фотодетектор с рабочим окном и кювета с сифоном для введения в нее реагентов, о т л и ч а ю щ а - 15 я с я тем, что, с целью улучшения эксплуатационных характеристик кюветной ка- меры, кювета установлена непосредственПодача юазод

UHHHHH Заказ 1 824/3 Тираж 723 Подписное

Филиал ППП "Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

72

Предлагаемая кюветная камера может найти широкое применение в научно-исследовательских учреждениях при проведении массовых исследований с различными целямии.

Формула изобретения

8782

6 но на рабочем окне фотодетектора н между кюветой и фотодетектором размещен слой оптической смазки, причем кювета снабжена дополнительным сифоном и связанной с ним системой вакуумного отсс са и продувки реагентов газами, а светонепроницаемый корпус кюветной камеры установлен на опоре шарнирно.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США % 3359973, кл. 128-1, 1967.

2. Данюков Ю. Г. и Мильман Л, С.

Упрошенный фотоэлектрический прибор для энзиматического определения АТФ пр«помоши системы люциферин-люцифераза, Вопросы медицинской химии, т. 2, в. 5, с. 548-555, 1966 (прототип).