Способ получения иммобилизованных нуклеаз
т( е» °: .а
ИЗОБРЕТЕН ИЯ на с.
Союз Советских
Социалкстнческих
Республик
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6l ) Дополнительное к авт. свил-ву— 2 (22) Зая влено 1 9. 01.76 (2 I ) 231 4787/23-04 (5 I ) M. КЛ. С 07 6 7/02 с присоединением заявки,% Государственный комитет (23) Приоритет— Опубликовано 30.04,80. Бюллетень И 16 Дата опубликования описания 02.05.80 о делан изобретений н открытий (53) УДК577.15..07 (088.8) (72) Авторы изобретения Б. М. Куриненко, И. E. Черепнева и И. И. Алексеева Казанский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. В. И, Ульянова(.Ленина) (7I) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КУКЛЕ АЗ Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментов посредством их связывания с растворимой матрицей, который может быть чспользован в медицине для получения лекарственных препаратов на основе ферментов (эн5 зимотерапия), а также в промышленности. Иммобилизованные на декстранах ферменты могут применяться в реакторах промышленного типа при создании циклических и непрерывных технологических про10 цессов с использованием полупроницаемых мембран для удаления продуктов реакции из смеси фермента с субстратом. Перспективы использования ферментов 15 как лекарственных препаратов очень велики, однако применение их в настояшее время довольно ограничено и не отвечает потенциональным возможностям столь эффективных катализаторов. Одним из недостатком ферментов, ограничиваюших их применение в качестве лекарственных препаратов, является их низкая стабильность, вследствие чего ферменты, введенные в организм в качестве биологически активного вашества или лекарственного препарата, очень быстро разрушаются. Известпо несколько способов увеличе» ния стабильности ферментов: физико-химические методы, основанные на подборе оптималытых для хранения ферментов условий (), pH,t активаторы .и т.д.) $1), иммобилизации ферментов на нерастворимых матрицах (2) и микрокапсулирование, т.е. включение нх внутрь мельчайших капсул, непроницаемых для фермента Я . Для усиления биологической активности ферментов методы подбора оптимальных условий непригодны, так как эти условия можно поддерживать только ц v Кто, но не в организме, гомеостатические механизмы которого изменят эти условия в соответствии со своими внутренними параме трам и. Иммобилизации ферментов на нерастворимых матрицах может быть пригодна для «силения биологической активности ферментов в тех редких случаях, когда они вы5а 3 7306 полняют свои функции в организме в нерастворимом виде (например, усиление пищеварительной функции желудочно-кишечного тракта). Микрокапсулирование пает возмож5 ность получать стабильные ферменты в инъекционной форме, и, следовательно, может расцениваться как способ усиления биологической активности ферментов. Однако стенки микрокапсул непроницаемы 10 для макромолекул фермента. Равным образом и субстраты, имеющие молекулярный вес, соизмеримый с молекулярным весом фермента, а тем более превосходящим его (белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды), внутрь капсулы проникать не могут. Следовательно, микрокапсулировацные ферменты не катализируют преврашение таких субстратов и этот способ усиления биологической активности ограничен gp ферментами, преврашающими низкомолекулярные субстраты, проникаюшими через мембрану микрокапсулы. Наиболее близким к предлагаемому яа ляется способ иммобилизации ферментов 25 посредством их связывания с водорастворимыми матрицами g4). По этому способу иммобилизацию ферментов осуществляют следующим образом, Йекстран, ЙЭАЭ-декстран или раствори- 30 мую КМ-целлюлозу растворяют в воде, рН 11,0. добавляют при перемешивании водно-ацетоновый раствор 2-амино- 4,6 дихлоро- 3 -триазина. Реакцию останавливают подкислением реакционной смеси до 55 рН 3,0-4,0. Активированные полимеры осаждают ацетоном, переосаждают и используют для связывания с ферментами. Связывание проводят, добавляя к раствоФ ру активированного полимера в боратном 0 буфере (рН 8,8) раствор фермента и выдерживают реакционную смесь в течение 16 час при комнатной температуре. Реакцию останавливают доведением рН смеси до 6,0 и удаляют несвязавшийся фермент 45 ультрафильтрацией. Для иммобилизации фермента используют препараты декстрана и ДЭАЭ-декстрана с молекулярным весом порядка 2000000. Е1ель изобретения — усиление биологической активности нуклеаз с сохранением их инъекционной формы, т.е. обеспечение их проницаемости и создание эффективной концентрации во внутренней среде организма в течение продолжительного време* ни и увеличение противовирусного и противоопухолевого действия препаратов. Указанная цель достигается тем, что нуклеазы выделенные из организмов, фиР 90 4 логенетически удаленных от организмамишени, ковалентно связывают методом диазосочетания с растворимой матрицей, м-аминобензилоксиметилдекстраном, причем используют м-аминобензилоксиметилдекстран с мол.вес. 40000-60000. Для нахождения оптимальных парамет ров для препаратов нуклеаз, обладающих противовирусным и противоопухолевым действием, изучают зависимость между мол.вес. иммобилизирующего декстрана и биологической активностью модифицированных нуклеаз. Устанавливают, что выраженной биологической активностью, в пределах в личин, приведенных в табл. 1, обладает только нуклеаза, связанная с декстраном с мол вес. 40000. Фермент, связанный с декстраном с мол.вес. 20000 и 60000, имеет стабильность, практически одинаковую с ферментом, связанным с декстраном с мол.вес. 40000. Однако он обладает противоопухолевым действием только при контактном (непосредственном) способе воздействия на опухоль (опухоль развивается внутрибрюшинно — фермент вводится внутрибрюшинно). При опосредованном способе воздействия (опухоль развивается внутрибрюшинно — фермент вводится внутримышечно; опухоль развивается подкож- но — фермент вводится внутримышечно) биологическая активность модифицированных ферментов не отличается от таковой нативн ого. Это объясняется тем, что фермент, связанный с декстраном с мол.вес.60000, не распространяется в организме, оставаясь локализованным в месте введения и, следовательно, не достигает опухоли при попытке опосредованного воздействия на нее. Скорость распространения в организме фермента, связанного с декстраном с мол. вес. 20000, не отличается от скорости распространения нативного фермента, Тем самым модифицированный фермент быстро выводится из организма, его эффективная концентрация создается только в месте введения и быстро падает из за выведения фермента из организма. Таким образом„наряду со стабильностью модифицированного фермента молекулярный вес модифицирующей матрицы имеет большое значение для увеличения би логической активности фермента. М олекулярныи вес матрицы должен быть таким, чтобы обеспечить проницаемость фермента и наибольшее время поддержания его эффективной концентрации в организме. Для нуклеазь See . ma cesce s, модифици5 .730690 рованной декстраном, наиболее оптимальным является его мол.вес., равный 40000. Для рибонуклеазы несколько шире— 40000-6 0000. Усиление биологической активности ферментов поясняеп я примерами нуклеазы Ser.гоабcescene и рНказы Ас1. irno aus, поскольку они выделены из организмов, далеко отстоящих в филогенетичес ком отношении от организма-мишени (мле- lo копитающие). Ковалентное связывание с декстранами нуклеолитических ферментов, выделенных из организма млекопитающих, например, панкреатических ДНказы и РНказы, также сопровождается их стабилизацией, но не приводит к заметному усиле- нию биологической активности этих ферментов, остающейся на уровне биологической активности дативных ферментов. Neханизм этого явления имеет непосредствен О ное отношение к вопросу усиления биологической активности ферментов. Панкреатические нуклеазы, вы деленные из поджелудочной железы крупного рогатого скота, при введении в организм мле- 25 копитающего-мишени эффективно ингибируются ингибиторами мишени. По отнош нию к нуклеазам, выделенным иэ.филогенетически удаленных организмов, ингибиторные механизмы мишени мало эффектиэ- ЗО ны в силу их филогенетической удаленности от ферментов. Поэтому введение в организм млекопитающего од ой и той же дозировки в равной мере стабилизированных ферментов, но выделенных из разных . источников, сопровождается разным уровнем подъема каталитической активности данного типа в организме. Наибольший уровень подъема активности наблюдается при введении в организм стабилизированного фермента, филогенетически удаленного от организма-мишени. E результате и биологический эффект единицы каталитической активности, введенной в организм противоопухолевое и противовирус1 45 ное действие на единицу активности) для этого фермента имеет более высокое значение. Наблюдаемое явление носит общий характер, т.е. в любом случае увеличение Я биологической активности ферментов максимально при стабилизации ферментов, филогенетически удаленных от организмамишени. Возможны частные случаи увеличения биологической активности при стабилизации филогенетпчески родственных ферментов, если при этом происходит нарушение их взаимоотношений с ингибиторными системами организма-мишени, однако на данном этапе развития они не носят закономерного характера. Иммобилизация ферментов осуществляется путем их связывания с растворимой матрицей методом диазосочетания. С помощью метода диазосочетания возможно осуществить связывание через амико», сульфгидрильные-, циклические и гетероциклические группы аминокислот, что позволяет осуществлять связывание через максимально возможное число точек и, следовательно, получать наиболее стабильные препараты ферментов. Мультипотентность реакции диазосочетания дает также возможность направленно изменять ассортимент иммобилизованных ферментов, свя» занных с декстраном через качественно различные аминокислотные остатки. Процесс проводят следующим образом. Активированные путем введения в них м-амипобепзилоксиметилы ого радикала декстраны обрабатывают раствором Яа80 в 0,5 н. НС1 при температуре от 0 до +2 С; рН образовавшегося раствора диО азодекстрана доводят до 3-4. Ферменты растворяют в 0,2 М трио-НС1 буфера (pH 8,5) и добавляют при перемешивании к диазодекстрацу. Смесь оставляют на 10-14 ч при 20 Ñ. Ковалентно связанные с декстранами ферменты отделяют от продуктов реакции при помощи гельфильтрации на сефадексах g -75 или Q -100. В результате увеличивается в 3-5 раза стабильность ферментов, характеризуемая термостабильностью, стабильностью при хранении, стабильностью в растворах мочевины и во внутренней среде организма. Очищенные ковалент» но связанные с декстраном ферменты используют ELG÷åå B качестве лекарственных препаратов. Пример 1 . Получение и изучение противоопухолевогс действия ковалентно связанной с декстранол4 нуклеазы 5е т, ъагС es ce nS. а). Получение ковалентно-связанной с декстраном нуклеазы Бег. загсе зсе е и изучение ее стабильности. 1 20 мг м-аминобензиноксиметиндекстрана, содержаниеазота 0,7%, растворяют на холоду в 1 мн 0,5 н. раствора НС1. К полученному раствору добавляют 30 мг Na80 . Диазотйрование проводят в тече- ние 5 мин. Добавляют О,06 мл NaOH (3,5и.), доводя рН реакционной смеси до 3-4. К раствору образовавшегося диа: одекстрана при постоянном перемешивании 730690 йриливают 25 мл раствора фермента в 0,2 М трис-НС1 буфере рН 8,5. Общее количество добавленного белка 97,5 мг. Реакционную смесь оставляют на 10-14ч при 20 С и спустя указанное время отдео ляют ковалентно связанную с декстраном нуклеазу от непрореагировавших декстрана и фермента гельфильтрацией на сефадексал Ci-75 или Q-100, уравновешенных фосфатным буфером рН 7,2 0,05 N. Стабильность связанной с декстраном нуклеазы проверяют прогреванием при 60 С в течение 30 мин, а также обработ кой мочевиной в конечной концентрации 2 М и 4 М (контакт с мочевиной30мин с последуюшим ее удалением диализом против фосфатногобуфера в течение 1,5сут.). Термостабильность связанного фермента, выражаемая процентом сохранения ак*тивности после 30 мин прогрева, состав20 ляет 66% (для нативного 10%). После обработки 2 М мочевиной сохраняется 94% активности связанного фермента (для нативного 45%), после обра25 ботки 4 М мочевиной сохраняется 42% (для нативного 10%). Связанная с декстраном нуклеаза хранится в растворе в течение 1,5 месяцев при 10-15ОС без потери активности,тогЗо да как нативный фермент в этих условиях теряет 50% активности. Связанная с декстраном нуклеаза сохраняется в питательной среде культуры ткани около недели без потери активности, зз тогда как нативный фермент теряет активность полностью в течение 1-2 сут. (в зависимости от исходной концентрации) Введенный в брюшную полость мышей, зараженных асцитной формой карциномы Эрлиха, нативный фермент исчезает полностью в течение 3-4 ч, тогда как связанный - 1 2-2 4 ч. б) Изучение противоопухолевого действия связанной с декстраном нуклеазы. Таблица 1 Фермент Асцитin связан ная 83 с декстраном Карцинома Эрлиха iS. Саркома 37 в/м 50 в/6 Исход-i Асцитная ный фермент Карцинома Эрлиха в/6 30 Саркома 37 в/б Изучение противоопухолевого действия проводится на двух перевивных опухолях мышей: асцитпой форме карциномы Эрлиха и солидной форме саркомы 37. Противоопухолевая активность препаратов учитывается после окончания курса лечения, идентичного IIo дозам и способам введения для нативного и соответственно иммобилизованного ферментов, и оценивается рядом критериев. Данные противоопухолевой активности нативного и модифицированного препарата нуклеазы приведены в табл. 1. м-Аминобензилоксиметилдекстран в количествах, содержашиХся в препарате ковалентно связанной с декстраном нуклеазы противоопухолевым действием не обладает. Проведенные исследования показывают, что биологическая активность нуклеазы, проявляюшаяся наличием у нее противоопухолевого действия, значительно возрастает после связывания фермента с растворимым декстраном. Пример 2. Получение ковалент но связанной с декстраном рибонуклеазы Ас(.r irnoGus и изучение ее противовирусного дейс твия. а) Способ получения ковалентно связанной с декстраном рибонуклеазы и изучение ее стабильности. 1 1, 0 г м-аминобензилоксиметилдекстрана растворяютна холоду в 100 мл 0,5 н. НС1, К полученному раствору добавляют 400 мг НаМО . Диазотирование проводят в течении 5 мин. Добавляют 3 мл NaOH (3,5 н.), доводят рН реакционной смеси до 3,0. К раствору образовавшегося диазодекстрана при постоянном перемешиванпи приливают 7,5 мл раствора рибонуклеазы B 0,4 М трис-буфере рН 8,5 (общее количество добавленного фермента 1,0 r) Реакционную смесь оставляют на 10-14 ч при 20 С и спустя указанное время отделяют ковалентно связанную с декстраном ° рибонуклеазу от непрореагировавших дест рана и фермента гельфильтрацией на сефадексе Q -75 или 5-100, уравновешенных фосфатным буфером рН 7,2 0,05 М. Нативный фермент Иммобилизоваиный фермент 200000 210000 75 Составитель А. Бочаров Редактор В. Зарванская Техред М. Кузьма Корректор Е. Папп Заказ 1449/7 Тираж 495 Подписное 1IH ИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж35; Раушская наб., д, 4/5 Филиал ППП "Патент", r.Óæãîðîä, ул.Проектная, 4 9 7306 Стабильность связанной с декс трапом рибонуклеазы проверяют прогреванием при 60 С в течение 30 мин, а также обработо кой мочевиной в конечной концентрации 6. М (контакт с мочевиной 30 мин с последующим ее удалением против фосфат ного буфера в течение 1,5 сут.). Термостабильность связанного фермента, выражаемая процентом сохранения ак1тивности после 30 мин прогрева состав- io лает 54% (для нативного 6-20%), в зависимости от времени исследования фермента после растворения. У свежерастворенного фермента термостабильность около20%, у хранившегося после растворения 5 в замороженном виде или при 4 С в течении 1,5-2,0 сут. термостабильность снижается до 3-6%. После обработки 6 М мочевиной сохраняется 56-60% активности связанного go фермента (для нативного 22%). б) Изучение противовирусного действия связанной с декстраном рибонуклеазы. Противовирусную активность изучают яа вирусе ящура штамм А 22, ananTHpo- zs ванном к белым, беспородным мышам. ЖБ вотных заражают внутривенным введением вируса в дозе 100 LD после чего сразу же начинают курс лечения нативным и параллельно иммобилизованным фермента- ЗО ми. Ферменты вводят дважды в сутки.: Противовирусное действие оценивается в процентах выживших. животных. Результа ты исследования приведены в табл. 2, Таблица 2 35 90 10 Из приведенных данных следует, что биологическая активность рибонуклеазы Act.rimoees, проявляющаяся в ее противовирусном действии, после иммобилизации декстраном существенно возрастает. м-Аминобензилоксиметилдекстран в ко личестве, соответствующем его содержанию в препарате ковалентно связанной с декстраном рибонуклеазы, противовирусным действием не обладает. Формула изобретения 1. Способ получения иммобилизованнык нуклеаз посредством их связывания с растворимой матрицей, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью усилении биологической активности нуклеаз с сохранением их иньекционной формы, используют нуклеазы, выделенные из организмов, фи. логенетически удаленных от организмамишени, которые ковалентно связывают методом диазосочетания с м-аминобензЩоко иметилдекс трапом. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что для иммобилизации нуклеаз используют м-аминобензилоксиметилдекстран с мол.вес. 40000-60000. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Диксон М Уэбб Э.,Ферменты, "Мир", 1966, с. 19. 2. Кестнер А. И. Успехи химии. 1974, т. Х, вып.8. 3. Т. М. 8 . СЬсвц,Naut-е, 1971, 229, % 5280, р. 117. 4,,Ю УРеь ХЯ., Y) animal Р, L,Ä „ Д) ос BiOPhve. Acta, 1971, 250, р. 522 (прототип).
