Способ получения сорбентов для аффинной хроматографии сериновых протеаз

 

734215

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 2410.77 (21) 2535.946/23-04 с присоединением заявки Hо (23) Приоритет

Опубликовано 15.05.80. Бюллетень ND 18 (51)М. Кл.2

С 08 В 15/00//

С 07 G 7/02

Государственный комитет

СССР оо делам изобретений открытий (5$ j УД)(5 4 7 . 0 7 . (088, 8) Дата опубликования описания 1105.80 (72) Авторы изобретения

С.А.Кудинов и Е.В.Ерецкая

Институт биохимии им. А.В.Палладина

AH Украинской ССР ) ) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТОВ ДЛЯ АФФИННОИ

ХРОМАТОГРАФИИ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕАЗ

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам полуЧения сорбентов для аффинной ° хроматографии протеаз серинового 5 типа и может быть использовано в ферментной г. — »омышленности для получения препаратов высокоочищенных протеаз серинового типа, которые находят применение в различных облас-10 тях.

Аффинная хроматография является наиболее эффективным методом, позволяющим выделить многие биологически активные вещества с высокой степенью очистки.

В литературе описан ряд способов получения сорбентов для аффинной хроматографии протеаз серинового типа. Известен, например, способ получения таких сорбентов, основанный на взаимодействии хлорсульфонированного сополимера стирола и дивинилбенэола в качестве носителя с N-(и-аминобензил) -L -тирозином (1). 25

Основным недостатком этого способа является использование в качестве лиганда N †(п-аминобензил)-L-тирозина, снижающее специфичность сорбента.

3тот сорбент не позволяет получать протеолитические ферменты, в частности, серинового типа, в чистом виде.

Известен также способ получения сорбентов для аффинной хроматографии сериновых протеаз путем -взаимодействия носителя полимерной структуры с аминокислотой Ь-лизином в присутствии активатора f2).

Известный способ предусматривает использование в качестве носителя сефарозы, которую активируют бромцианом. Йспользование этого носителя резко ограничивает воэможность использования получаемого сорбента для аффинной хроматографии в промышленных масштабах, поскольку сефароэа является малоустойчивым полимером, Ф что не позволяет использовать ее длительно и многократно. Кроме того, известный сорбент имеет небольшую емкость по отношению к сериновым протеазам.

Целью описываемого способа является устранение недостатков известного способа, то есть расширение ассортимента биоспецифических сорбентов и улучшение их технологических характеристик, в частности повышение

734215

Опыт, Р зин» оксиметилюлоэ а

24,5

24,5

23,8

25,1

24,6

14,2

13,9

13i0

14,0

13,9 емкости по отношению к сериновым протеазам и обеспечение возможности длительного и многократного использования.

Описывают способ получения сорбентов для аффинной хроматографии сериновых протеаз с улучшенными техноло5 гическими хаРактеристиками путем взаимодействия носителя полимерной структуры с аминокислотой L-лизином в присутствии активатора, причем в качестве носителя используют целлюлозу или ее карбоксиметилпроизводное, а целевые продукты выделяют промывкой буферными растворами, содержащими 0„ 5 M NaCI этанолом и высушиванием. 15

В качестве носителя для иммобилизации лиганда, L-лизина, используют целлюлозу, которую активируют бромцианом,или карбоксиметилцеллюлозу, которую активируют дициклогексил- 20 карбодиимидом. L-лизин связывают с носителем. Если в качестве носителя используют активированную BrCN целлюзозу, то связывание L-лизина производят после отмывания носителя от избытка активатора. Если в качестве носителя используют карбоксиметилцеллюлозу, то ее связывание с L-лизином осуществляют в присутствии активатора, в качестве которого используют дициклогексилкарбодиимид.

Пример 1. Способ получения

L-лизинцеллюлозы в присутствии бромциана.

3 г целлюлозы суспендируют в 100 мл воды, охлаждают льдом, смешивают со

100 мл 2М раствора карбоната натрия.

При интенсивном перемешивании в смесь вводят 3 г бромциана, растворенные в 1,5 мл ацетонитрила. Через 4()

2 мин активированную целлюлозу фильтруют на воронке Бюхнера и последовательно промывают охлажденным 0,1М раствором- ИаНСОЗ, рН 9,5 (500 мл), водой (500 мл), 0,2 н.раствором

NaHCO, рН 9,5 (500 мл) .

3 r L-лизина растворяют в 100 мл

О, 2М раствора NaHCO рН 9, 5, и затем в этом же растворе суспендируют gp отфильтрованную активированную целлюлозу. Смесь оставляют на 18 ч при 4 С на магнитной мешалке.

Модифицированный сорбент фильтруют и промывают последовательно

0,1М раствором ацетата натрия, рН

4,0 (500 мл), 2н.раствором мочевины (500 мл), 0,1М раствором NaHCO>, (500 мп), рН 10,0 (все перечисленные растворы должны содержать 0,5М

NaCI7 этанолом (200 мл) и высуши- 40 вают на воздухе.

Пример 2. Способ получения

L-лизинкарбоксиметилцеллюлозы в присутсвии дициклогексилкарбодиимида (Дцкл) .

В водный раствор гидрохлорида

L-лизина (10 r в 150 мл воды) при рН 408 вводят 20 г карбоксиметилцеллюлозы и при постоянном перемешивании приливают по каплям в течение 20 мин спиртовый раствор ДЦКД (10 г ДЦКД в 20 мл этанола). Смесь оставляют при 10 С на 20 ч.

Полученный сорбент последовательно промывают на коробке Бюхнера этан олом, смесью э танол: вода — 1: 1, О, 001 н.HCI, водой, О, 1М NaHC0„, 0,05М фосфатным буфером, рН 7,4 (все перечисленные растворы должны содержать 0,5 М NaCI) вы сушивают на воздухе.

Хранят Ь-лизинцеллюлозу и карбоксилметилцеллюлозу в высушенном состоянии или в виде суспенэии в

0,05М фосфатном буфере при 4 С.

Специфическая емкость L-лизинцеллюлозы и L-лизинкарбоксиметилцеллюлозы определена на аминокислотном анализаторе AAA †8 (ЧССР) после кислотного гидролиза сорбента.

Данные сорбенты могут быть длительно и многократно использованы без снижения их специфической емкости .

В табл.1 представлены данные по определению специфической емкости при

5-кратном использовании сорбентов.

Та блица 1

Специфическая емкость Ь-лизинцеллюлозы и L-лизинкарбоксиметилцел— люлозы.

Специфическая емкость сорбентов, ммоль L-лизина

r сухого сорбента

Данные иследования высокоочищенного плазминогена, выделенного на сорбентах, получаемых по описываемому способу, и на известном сорбенте

L-лизинсвфарозе приведены в табл.2.

734215

Та блиц а 2

Выход и степень очистки плаэминогена, выделенного на L-лизинцеллюлоэе, L-лизинкарбокГиметилцеллюлозе и L-лизинсефароэе методом аффинной хроматографии

216

50

L-Ли эинцеллюлоэ а

L-Лизинкарбоксиметилцеллюлоэа

282

20 63 1380 69

L-Лиэинсефароэа

100 мл 31 ке/м 1260 12,6 ке/мл 190

Составитель A.Áoãàðåâ

Техред М.Петко

Редак тор Л. Нов ожил ова

Корректор М.Вигула

Заказ 2001/33 Тираж 549

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подпи си се

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Формула изобретения

1. Способ получения сорбентов для аффинной хроматографии сериновых протеаз путем взаимодействия носителя полимерной структуры с аминокислотой L-лизином в присутствии активатора, отличающийся тем, что, с целью расширения ассортимента сорбентов и улучшения их технологических характеристик, в качестве носителя применяют целлюлозу или ее карбоксиметилпроиэводное, а целевые продукты выделяют промывкой буферными растворами, содержащими 0,5M NaCI, этанолом и высушиванием.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю шийся .тем, что при использовании кар боксиметилцеллюлозы в качестве

30 носителя в качестве активатора примен яют дициклогексилкарбодиимид. 3. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что при v.cïoëüso35 ванин целлюлозы в качестве носителя активатора применяют бромциан.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

9476285, кл. С 08 В 27/00, 1974.

2. D.G.Peutsch, E.T.Mertr.

PIasminogen;purification from numen

pIasma by айй1п1 у chromatography, Science, 170, 1095-1096, 1970 (про45 тотип),