Способ получения водорастворимых антигенов

 

ОП ЙСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

<>736977

Союз Советских

Социалистических

Реслублик

К АВТОа СКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 22.11,77 (21) 2545951/28-13 с присоединением заявки— (23) Приоритет— (43) Опубликовано 30.05.80. Бюллетень № 20 (45) Дата опубликования описавия 30.05.80 (51) М Кч г A 6! К 35/34

Государствеииый комитет ссср ло делан иаобретеиий и открытий (5З) УД К 615.373.3 (088.8) (72) Авторы изобретения

А М. Борисова, В. Я. Арион и С. Н. Москвина

Второй Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

ВОДОРАСТВОРИМЫХ АНТИГЕНОВ

Изобретение относится ос области медицины, а именно к получению препарата анти генов миокарда,,которые |могут быть исаользаваны а диагностичеаких целях для выявления, например, активности ревматичес кото,процесса:и уточнения 1значения аутоиммунных IMcxBHH3tMolB IB раз витии ре вматизма.

Из|вестен апособ получения водорасPBoри мых анти генов из гкани миокарда отутем ее томогениза ции ic последующим центрифугированием il oiMoreHaTa и;выделением целевого ародукта.

Однако известный апособ не гарантирует высокую иммунологичесп<ую актлвность и чу1вст вительность антигенов.

Целью изобретения я вляет ся повышение иммунолопичеакой а:ктивности и чувсгвительности антиген эв.

Это достигается тем, что ткань гомогенизируют при 13000 — 17000 об/мин в лри сугствии О,ОЗ вЂ” 0,05 М Т(рис HCI буфера ,при рН 7,8 — 8,2, ломогенат центрифугируют ступенчато от ЗООО до 39ООО об/мин, полученный осадок ресуспендируют, обрабатывают па па1ином lIIpH oooòíîøåHHH етю к субсграту 1: 10 — 1 5 и выделяют;целевой иродукт хроматографически.

Кроме того, обработку птапаином проводят в течение 60 — 80 мин. А для,ресуапенди рования осадка и хроматографии используют 0,03 — 0,05 М Трис НСI буфер.

Способ осущеспвляют следующим образом.

Сердечную ткань, полученную от здороIBbIx лиц, погибших от случайных травм .и азятую,не,позднее 4 — 6 ч после смерти, отMbIIBàþò ют оорови, отделяют миокард и гомогенизируют в виоревс м смесите.те в 0,03—

О 05 М Трис HCI буфере (pH 7 8 — 8 2)

1 — !,5 мин при 13000 — 20000 об|мин. Полученную:массу затем подвергают дробному центрифуги ро ванию отри числе оборотоэ от

3000 до 3i9000,в минуту. Полученные в ре15 зультате дробнопо центрифугирования клеточные мембраны ресуапендируют в TDM гке объеме буфера и переводят антиген в раст воримое со стояние обработкой папаином при соотношении .фермент: белок клеточных

20 мембран = 1: 5 — 1: 25. Инкубацию с ферменто м проводят 1 ч ори 37 С. Добавляют ттодацетат натрия до конечной концентрации 0,05 М для ина ктлвации действия iaaлаина. Реапоционную смесь центрифугируют

25 1 ч луи 37000 об/мин. Супернатант собирают, концентрируют и íàHоcFT Hà х роматографичвакую,колон ку с сефадексом G — 200 (2,5Х100). Очищенный препарат собираюТ по 10 мл.;Всего былю собрано 56 лроб. Гельфильтрация позволяет разделить материал

736977

l0

65 на три фраации: А — с молекулярной массой не менее 200000 Дальтон (пробирKH 5 15); Б вЂ,с молекулярной массой

100000 — 35000 Дальтон (пробирки 17 — 35), В- фр аукци я — материал с молекулярной массой менее 35000 Дальтон (пробирки

37 — 56). Все три фракции 1кон центрируют ультрафильтра цией,на мембранных фильтIpav. Существенно |важным для способа я вляепся выбор соотношения,па паин: белок клеточных мембран.

Наилучшие результаты получены,при соотношени и,фермента IK субстрату 1: 15—

1:20 и температура реаиции 37 С, В этом случае растворимый антигенный материал обладает наи болышей aIKTHIBHQcTbIo и почти целиком обна ружи вается во фракции Б.

Очищенный;материал фраиции Б,позволяет диагHOIcTHpoBaTb скрыто- и вялотекущие ревматичежие процессы (ревматизм 1 степени активности). Для выявления а кти(вного,ревматического процесса требуется всего юдна единица продукта, в тю время, как в известном способе необходимо не менее 20 единиц антигеннопо материала.

Способ поясняется следующими примерами.

П ip и м eip 1. И змельченную ножницами ла холоде (от +il до +,2 С) ткань миокарда гомагенизируют 1,5 мин при 13000 об!мин в 0,03 — 0„05 М Трис НС1 буфера при рН

7,8 8,2. Гомогенат центрифугируют 1О мин при 3000 об/мин, супернатант собирают и лентри фуги руют 1 5 ч при 39000 об/мин (1О5000 g) на п репарати вной ультрацентрифуге.

4лса дак (клеточные мембраны) рвсуспендируют;в т ам же буфере и обрабатывают папанином,при соотношении фермента к субстрату 1:25. Иикуба цию с ферментом проводят 1 ч при 3i С. Добавляют иодацатат натрия до конечной;кон центра ции 0,05 М для инактива ции действия папаина. Реакционную смесь снова центрифугируют 1 ч лр:и 37000 об/мин (887i90 g) iB том же роторе. Супернатант собирают для дальнейшей очистки хроматографией на,колонке с сефадекоом G — 200 (2,5Х1ОО см). Пробы собирают по 10 мл. В свго собрано 56 проб.

Полученные фраиции клеточных мембран миокарда кон цен"курируют с помощью ультрафиль"про в на аппарате фир,мы «Аппсоп»

1 олландия.

Антигенную активноcTb полученных клеточных .мам бран миакарда апредечяют,во всех 56 проби р ках с,помощью реакции торможения миграции леикоцитов ка к у боль:ных с клинически выраженным ревматическим процеосом (11 степень активности), так и у больных с минимальной активностью ревматизма (I .степень активности), с неактивной фазой ревматизма и в контрольной,группе, HipH оценке антигенной активности полученных,клеточных мембран миокарда берут, различные концентрации антнгена с содержанием от 1:мкг до 150 мкд бел,ка. Причем, у одного больного одновременно изучают все франщии, т. е. антигены берут из- разных проби рюк соопветственно фракциям. В качестве контрольных антигеHoIB используют фраиционированные антигены печеночной ткани, экстракты почечной ткани, cHHQIBiHaJIbHQH ткани, скелетной мышцы, а также водно-солевые экстракты ñåðдечной "пкани.

Антигенная активность выявлялась в пробирках,за номерами от 5 до 35 включительна, ае пробирках от 36-й до 56-й не выявлялось при сутствие антигена. Причем, для .выявления активного ревматического процесса у больных с клинически ярко выраженной активностью необходимо было брать не менее 10 — 15 мкг белка из пробирок с 5-й по.15-ую и 1 — 2 мкг беляка .из про бирок 17 — 35. Для |выявления же активного процесса у больных с минимальной стеленью aiKTHIBHocTH необходимо было брать

2!5 50 мкг белка из пробирок 5 — 15 и

3 — 5 мкг белка из пробирак с 17 по 35.

Таким образам, активны|ми IB антигенном отношении оказались фракции А (пробирки

5 —,15) и Б (проби р ки 17 — 35). Фракция В оказалась неактивной, т. е. состоящей из балластных белкав и не содержащей антигеннопо материала. Самой активной фракцией оказалась Б фра к ция. Для выявления даже минимальной активности ревматизма необходимо всего 3 — б мкг .белка этой фракции, тогда.как фракция А,,по-,видимому, загрязнена другими белками мембран и:поэтому.в реакцию необходимо брать большее количество,материала (25 — 50 мкг белка).

П р и м е:р 2. Все процедуры проделывают, IKBK:в примере 1, но соотношение фермента папаина к белку клеточных мембран берут 1: 5.

Антигенная aKTHIBHoIcTb клетсчных мембран миокарда обнаруживалась как во франции А, так и iBo фракции Б, но только у больных с .я рко выраженной àKTHIBHocTbIQ ревматичесиого процесса. У больных с минимальной активностью ревматическогопроцесса работала толыко фракция Б, но с болвшей ковцентра цией антигена, чем в п р и мер е 1 (1 Π— «15 л кг) .

Таким образом, при соотношении фермента па паина .к белку, клеточных мембран

1: 5,происходит разрушение фе рментом акTHIBHoTo материала, следовательно, IB даннс м случае было взято фермента в избытке и часть антигенов раз рушилась, .поэтому выход антигенного материала оказался небольшим.

Пример 3. Все процедуры получения водорастворимых антигенов миокарда проводятся, как в первых двух приыерах, но соотношение фермента па паина к белку,клеточных, мембран берут 1: 15. П ри данных условиях выделения антигенов миокарда антигенная а кти внюсть наи-.

736977

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Техред А. Камышникова Корректор И. Осиновскаи

Редактор Г. Прусова

Заказ 575/713 Изд. № 309 Тираж G49 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )К-35, Раушская наб., II. 4/5

Тип. Харьк, фпл. пред. «Патент» более выражена во фракции Б клеточных мембран миокарда. Меньшая активность антигена отмечена во фракции А, фраиция

 — неактивна. У больных с минимальной степенью активности (I степень) для выявления ревматического процесса дсстаточно было антигена клеточных мембран миокарда с концентра цией белка из фракции А от

12 мкг .до 1О якг, а в Б фра кции всего

1 — 12 лкг белка. У больных с выраженным 10 ревматичеаким п рацессом (II степень активности) для диа гнастыии достаточно было

1 лжг антигена фракции А, а фракции Б—

1 мкг и менее.

Исходя из вышеописанных,данных весь материал, полученный .после очистки .на сефадеисе G — 200 объединяют в три фракции: фракция А с лорядкавым номером пробирок от 5 до 15 включительно, фракция

Б — п робирки с.порядковыми номерами от 20

17 до 35,включительно, и фракция  — пробирки с порядковыми номерами от 37 до 56.

Полученные всдорастворимые фракции клеточных мембран миакарда исследовали в реаыции торможения,миграции лейкоци- 25 тав у 300 человек, из .которых 150 были больны .ревматизмом, 150 составляли контрольную пруплу. В,контрольной грулпе торможение миграции лейкоцитов на антигены клеточных мембран миокарда не от- 30 мечалось. Индекс ми грации лейкоцитов у здоровых лиц составлял не менее 96%.

У остальных лиц контрольной группы (людей с другими заболеваниями) средняя вели чина индекса IMHII ðà öHH лейкоцитов была также выше 80% (от 91 до 136%).

У больных активным ревматизмом отмечалось отчетливое торможение миграции лейкоцитов, оно было iropawo более вы раженным, чем mpH использовании водно-со- 4о левых экстрактов миокарда. Средняя величина индекса миграции лейкоцитов у больных актлвным ревматизмом при использовании одинаковых концентраций антигенов, но разных фракций дает следующие результаты: фра иция А составляла 35 — 49%, фракция Б — 20 — 33%, а ф>ракция  —.

94 — 102%. Следовательно, наибольшее торможение vrHillpaIIHH лей кацитав, т. е. наилучший результат, gают антигены, взятые из фракции Б.

Предлагаемый способ гарантирует высокую иммунологичеакую активность и чувспвительность антигенав, что ill03IB0JJ5lCT улучшить диагностику заболевания, а также возможность обнаружения скрытых и вялотекущих форм сердечных заболеваний.

1. Способ получения водорастворимых антигенав из ткани миокарда:путем ее гомогенизации ic последующим центрифуги рован ием гомогената и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения иммунологической aKTHiBности и чувспвительност и антигенов, ткань гомогенизируют цри 13000 — 17000 об/,яин в при супспвии 0,03 — О,О5 M Tpuc HC1 буфера лри рН 7,8 — 8,2, гомогенат центрифугируют ступенчато от 3000 до 39000 об/л ин, лолученный осадж ресуспендируют, обрабатывают папа ином лри соотношении его к субстрату 1: 10 — 15 и выделяют целевой п родукт хроматогра фичеаки.

2. С погоб по,п. 1, о т л.и ч а ю шийся тем, что обработку палаином проводят в течеоие 60 — 80 лтин.

3. С пособ lIlo п. 1, о т л,и ч а ю шийся тем, что,для;ресуапендирования осадка и хроматографии используют 0,03 — 0,05 М

Транс НС1 буфер.