Способ получения модифицированного глобина
О и И - И- -"Е
4 г Союз Советских
Социалистических
Республик
ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (51)М. Кл. (22) Заявлено 080877., (21) 2544365/28-13 с присоединением заявки ¹ —. А 61 К 37/02 А 61 1< 35/14 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открыти и (23) Приоритет Опубликовано 050680. Бюллетень № 21 (53) УДК 615. 45 616, ..155.16(088.8) Дата опубликования описания 080680 (72) Автор изобретения К.A. Лобунец Киевский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО ГЛОБИНА Изобретение относится к медицинской промьталенности и касается получения белковых препаратов — плазмозаменителей. Известен способ полуумения модифи- 5 цированного глобнна иэ эритроцитов донорской крови путем отмывания эритроцитов от остатков плазменных белков и лейкоцитов, гемолиэа эритроцитов, удаления стромы, выделения гло- 1О бин-гидрохлорида, щелочного гидролиэа с последующей нейтрализацией щелочного раствора глобина, очисткой и стерилизацией (1). Однако известный способ является трудоемким и выход глобина состав.ляет 61%. Целью изобретения является упрощение технологии производства и повышение выхода целевого продукта. 20 Эта цель достигается тем, что рН раствора гемоглобина освобожденного от стромы доводят до 2,0-2,4 при температуре 6-10 С, добавляют раствор перекиси водорода, повышают темпера- 25 туру до 50-54 С, проводят гидролиз при рН 12-13, центрифугируют, добавляют этанол .при температуре -5-7 С и при рН 5,7-5,9, центрифугируют, добавляют глюкозу. 30 Способ осуществляют следующим образом. Пример . Эритроциты крови человека любых сроков хранения одной или всех групп крови (смешанные), содержащие один из обычных цитратныХ антикоагулянтов, триждЫ отмывают физиологическим раствором хлористого натрия, используя для этой цели центрифугирование при 250()-3000 об/мин при температуре 4 С. Лейкоцитарную пленку удаляют сифоном.. Отмывание проводят из расчета 2 объема 0,9В-но- го раствора хлористого натрия на 1 объем эритроцитов. Отмытые эритроциты помещают в ре» актор. K 1 объему эритроцитов добав-. ляют 2 объема апирогенной охлажденной до 4 С воды и оставляют стоять в течение 1 часа для протекания гемолиза. Затем доводят рН раствора до 5,6 0,1 свежеприготовленным 1 н. раствором соляной кислоты при перемешивании в течение 60-90 минут. При этих условиях из гемолизата выпадает в осадок строма эритроцитов. для ее .удаления смесь центрифугируют при температуре 4 С в суперцентрифуге при 15000-20000 об/мин или в стаканчиковой — при 2500-3000 об/мин. ° Фil . 1 738622 Формула изобретения ЦНИИПИ Заказ 2710/5 Тираж 673 Подписное Филиал ППП Патейт, r. Ужгород ул. Проектная, 4 Освобожденный от стромы раствор гемоглобина заливают в реактор и доводят рН до 2,2+-0,2 2 н. раствором соляной кислоты. Температуру смеси понижат до 8+2 С. Затем к смеси при-. бавляют 6Ъ-ный раствор перекиси водорода из расчета 300-330 мл на 1 литр исходного раствора гемоглобина и перемешивают в течение 12-18 часов. После перемешивания температуру смеси повышают до 524 2 С, выдерживают в течение 1 часа и добавляют 2 н. раствор NaGH из расчета 190 мл на 1 литр исходного раствора гемоглобина для достижения рН 12-13. После добавления целочи смесь выдерживают при указанной температуре 60-90 минут. Затем к смеси прибавляют 15-16,5%-ный раствор перекиси водорода иэ расчета 50 мл на 1 литр исходного раствора гемоглобина и прогревают при указанной температуре не менее двух часов, 20 параллельно контролируя изоточку глобина. Если изоточка глобина находится в пределах pH — 5,5-6,5, то процесс очистки era от гема закончен, а сам белок является водорастворимым при нейтральных значениях рН. Смесь охлаждают до 18-20 С и доводят рН 1 н. раствором соляной кислоты до 7,2-0,2. Смесь центрифугируют + для удаления части гема при комнатной температуре и 2500-3000 об/мин в течение 30 минут. Затем понижают температуру центрифуга до 0 С и начинают прибавлять 96Ъ-ный этанол до конечной концентрации его в смеси 12-15%, параллельно продолжая понижать температуру до -6 1 С. Смесь перемешивают в течение двух часов (при необходимости в производственных условиях перемешивание можно осуцествлять в течение 12-18 часов) . За- 4Q тем рН смеси доводят 1 н. раствором соляной кислоты до 5,8 0,1 и центрифугируют при -6 1 С, 1500-2000 об/мин в течение 20-30 минут. Надосадочную жидкость, содержащую экстракорпускулярный калий, низкомолекулярные фрагменты глобина и азотистые продукты удаляют и в дальнейшем не используют. Модифицированный глобин экстраги- руют из осадка добавлением к нему 10Ъ-ного раствора глюкозы в соотношении 1:5 или 1:6. Экстракцию проводят при температуре +4 С, рН вЂ” 9-10 в течение 8-12 часов. После чего смесь центрифугируют при 2500 3000 об/мин в течение 20-30 минут. Осадок, содержащий денатурированные стромальные липогликопротеиды с частью гема, удаляют, В полученном растворе коррегируют прибавлением 10%-ного раствора глюкозы концент- @) рацию белка до 6-8 г Ъ, а рН до 7>2+0,2 1 н. раствором соляной кислоты. Раствор препарата стерилиэуют в условиях бокса через керамические фильтры Ф-5, разливают во флаконы емкостью 250-500 мл, герметически укупоривают. Срок годности препарата не менее 2 лет. При лиофилизации раствора глобина с глюкозой срок годности увеличивается в 2 раза. Препарат представляет собой 6 8%-ный раствор модифицированного белка — глобина с 10%-ной глюкозой стабильного водораство1 имого при нейтральном значении рН, Относительная вязкость 2,0-2,4, содержит до 2030 мг Ъ остаточного азота, содержа+ф+ ние Fe в препарате не превышает 3 мг Ъ, количество хлористого натрия равно О, 8-1,2 г В, при электрофорезе на бумаге или на агаре Difco .белок препарата перемешивается одним пятном и по своей подвижности близок к подвижности преальбумина сыворотки донорской крови. Описанная технология позволяет получить стерильный, апирогенный лишенный вируса гепатита, нетоксичный препарат, пригодный для внутривенного введения в качестве плазмозаменителя. Выход целевого продукта модифицированного глобина достигает 70-76% от его содержания в исходном гемолиэате, Предлагаемый способ обеспечивает повышение выхода глобина и упрощает технологию производства. Способ получения модифицированно.го глобина из эритроцитов донорской крови. путем отмывания эритроцитов от остатков плазменных белков и лейкоцитов, гемолиза эритроцитов, удаления стромы, выделения глобин — гидрохлорида, целочного гидролиза с последующей нейтрализацией целочного раствора глобина, очисткой и стерилизацией, о т л и ч а ю щ и и c я тем, что, с целью повышения выхода, упроцения технологии производства, рН раствора гемоглобина, освобожденного QT стромы, доводят до 2,0-2,4 при температуре +6-10 С, добавляют раствор перекиси водорода, повышают температуру.до 50-54 С, проводят гидролиз при рН 12-13, центрй@угируют,добавляют этанол при температуре -5-7 С и при рН 5,7-5,9,. центрифугируют, добавляют глюкозу. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1, Labor 1. C1in. Мей., 1951, 37, 6.
