Способ определения активности моноаминоксидаз в биологическом материале

 

Ф

<1СФ 4

yQ т з и 1-;, - т .;;-;.,:", г; с и фЯ

ОЙ-ИС Н И Е

-ИЗОБРЕТЕН ИЯ 1,739381

Союз Советских

Социалистических

Республик

Ф

Ъ

Ф

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

/ (61) Дополнительное к авт. свил-ву (22) Заявлено 25.11.77 (2l ) 2545990/23-04 с присоединением заявки №вЂ” (23)Г1рипрятет— (51) М. Кл.

С. 01 М 21/24

Государственный комитет

Опубликовано 05. 06.80. Бюллетень. № 2 1 да делам наобретеннй н открытий (53) Уд К .543.4 3. .06 2 (088.8) Дата опубликования описания 09.06.80 (72) Автор изобретения

А. И. Балаклеевский

Минский государственный медицинский институт (7l) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МОНОАМИНОКСИДАЗ

В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

NH.+NH +Н р

Изобретение относится к биологическим (биохимическим) методам исследования и предназначено для определения активности ферментов моноаминоксидаз (NAO) в биологическом материале с использованием в качестве субстратов индольных биогенных

5 аминов.

Известен способ определения активнос- ти моноаминоксидаз в биологическом материале путем обработки тирамина в сла10 боосновной среде инкубации избытком семикарбазида в присутствии моноаминоксидазы с последующей обработкой полученной смеси раствором трихлоруксусной кислоты, избытком 2,4-динитрофенилгидразина экстракцией образовавшегося 2,4У динитрофенилгидразона бензолом, обработкой щелочью бензольного экстракта и спектрофотометрированием полученного соединения (1) .

Недостатком известного способа является его недостаточно высокая чувстви-! тел ьност ь, Цель изобретения - повышение точности способа.

Указанная пель достигается тем, что серотонин или триптамин, используемые в качестве амина, обрабатывают в слабоосновной среде инкубации избытком семикарбазида в присутствии моноаминоксидазы с последующей обработкой полученной смеси раствором трихлоруксусной кислоты, избытком 2,4-динитрофенилтидразина и измерением оптической плотности полученного раствора.

Из серотонина (или триптамина) в сре де инкубации, содержащей фосфатный буфер с рН 7,4 и избыток семикарбазида, в при-, сутствии МАО получают 5-оксииндолилацетальдегид (или индолилапетальдегид) ИО /, 1 СН СН2 ЙН Н0 Н фен,-t . +

NH o+p а Щ

3 который, взаимодействуя с семикарбазидом, дает семикарбазон (что предохраняет альдегид от дальнейшего окисления) СН>-С=К-С-Ми

1iu NH

Н НО 1

После удаления блоков с помощью три хлоруксусной кислоты в пробу вносится избыток 2,4-динитрофенилгидразина, который взаимодействует с семикарбазином, образуя гидрофобный гидразон

ИО

CH -С-N=c

11

H Н 0

NH +H N-N МО

NO . 2

ИО

t-H-Ñ=ì-и- / i NO

-, — а+ зо

NH н И Ко

+н м-и- .-нн

2 > ji 2 о

Гидрофобный гидразон 5-оксииндолилацетальдегида уже через несколько минут об- 55 разует мелкодисперсную суспензию, концентрация которой, а вместе с этим светопоглощение и светорассеяние, постепенно возрастает, достигая максимального устойчивого значения в течение 20-30 мин. 4

Интенсивность светопоглощения (или светорассеяния) мутного раствора определяют турбидиметрически (или нефелометрически), используя любой доступный копориметр (нефелометр), микрокапориметр, ФЭК или 45 спектрофотометр.

Разница между экстинкцией опытной и контрольной (инкубация проводится в отсутствие субе грата биогенного а ййна или в отсутствие источника фермента) проб слу-, 30 жит мерой активности фермента в условных единицах после пересчета на 1 r свежей ткани или 1 мг белка за 1 ч инкубации.

Для пересчета активности МАО иэ ус55 повных в абсолютные единицы более доотупным является построение калибровочного графика с определением образующегося в

М0 сн -с

Ъ вЂ” а»

+Н М И-С-NH

ИН я 1 и

H 0

739381 инкубационной среде под действием МАО аммиака, так как получение весьма нестабильных альдегидов биогенных аминов и последующая работа с ними весьма затруднительнаа.

Инкубационная смесь состоит из компонентов, мл. раствор фосфатного буфера с рН 7,4; 1,0 0,1 М; нейтрализованный раствор семикарбазида солянокислого

1о 0,2 0,5%-ного; нейтрализованный раствор серотонин-креатининсульфата 0,25 1%-ного (6,25 мкмоль); (или раствор триптамина солянокислого; 0,25 0,2%-ного

2,5 мкмоль;); источник фермента (10%ные гомогенаты тканей, субклеточнИе фракции и др. 0,2-0,5).

После 1 ч инкубации при 37 С в пробы добавляют по 1,0 мп 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, после чего що их центрифугируют. В контрольнь|е пробы после трихлоруксусной кислоты добавляют субстрат. К прозрачному безбелковому центрифугату добавляют по 0,2 мл 0,1%--ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина, приготовленного на 2н. ржтворе соляной кислоты, и, образовавшаяся суспензия гидразона индолилацетальдегида, через 20-30 мин турбодиметрируется (на спектрофотометре или фотоэпектрокопориметре с зеленым фильтром) или нефепометрируется. При измерении на ФЭК-М экстинкция опытных проб, содержащих в качестве источника

МАО 10-25 мг. свежей ткани мозга или

1-3 мг белка, превышает экстинкци|о контрольных проб, инкубируемых без субстрата, в 20-30 раз, что позволяет надежно работать уже с малыми активносгями фермента и неочищенными препаратами (источниками) МАО. Прирост продукта ферментативной реакции и величины экстинкции в пробах прямо пропорциональны продолжительности инкубации (от

15 мин до 2 ч) и количеству источника фермента MAO в инкубационной среде (l-1ОО мг ткани). Митохондриальная фракция из ткани мозга и печени обладает максимальной удельной активностью

MAO. Метод высокоспецифичен дпя определения МАО, так как при введении в организм или добавлении в инкубационную среду больших доз ингибиторов МАО активность фермента полностью угнетается.

Точность. метода g 3% (из 5 параллельных определений). Чувствительность метода достаточно высокая для того, чтобы измерить активность МАО с, небольшими количествами различных тканей. 1 мкмопь продукта реакции, образующегося из серотонина, дает 0,5 единиц и из триптами5 7393 на 0,55 единиц прироста экстинкции в условиях предлагаемого метода (фЭК М, проба объемом 2,5, мл цовета с толщиной слоя раствора 0,5 см).

Малярный коэффициент экстинкции (8 ) гидраэона в суспензии равен 2000 М см для серотонина и 2200 М см для триптамина. Выход конечного продукта в форме гидраэона альдегида, образующего суспенэию, составляет 55% 1а для серотонина и 6 0% для триптами8l 6 на от всего количества эквивален тов образующегося в инкубационной среде в ходе ферментативной реакции альдегида (или аммиака).

В табл. 1 представлена активность

МАО с субстратом серотонином в мозге крыс после введения различных доз транс амина.

В табл. 2 лредставлена активность

МАО с субстратом триптамином в мозге крыс после введения трансамина.

739381 х х

Ф

Ь ф и

М

F Э

Г

»

Д

Ц о д о

Л Г х (о

cq „, Ф о

-"" o"

+(+(Д л

К

» о

И II о х

1 (ч и

М о а

П ф

Ф (ч

И о о}

0) о о о о

+f

К о

О

II

»о (O

Ф о

СЧ со о со о о о

М х м

Ji »1 х» ою иЦо о

Т"» o» о о

1- о о о

Т-» о о

0 ср

Я 1-» о О

Я

CD

«"» о

o o о со сО сб

o o o (0

Т-» о о

Щ

Т-» о о ф х х

2 а. и х

З,.х

Е х х

М

».

О а О

М

f к о

& о ъ

М (ч о2

О х

» х и о а

Ц„g (g Й о ж х в х g

О и

cd х

" х. (р E

q u х ч х (ч о в ."Е

А и (ч

8 о ж о

+I о» о g о о

Il о О сч о о о

03 6! со о о л со о о о со

0) .Я О)

o o o

<

Л„ ч и (ч

4 о о

С4 х ч и и с»

Э о

Т»» о о

+( о» о

Ol о и сч О»» о о л cq cg nt 00

0 0 0 О 0

ol o

Я р). »»

ОOO.O

o cu n

1» Т» Ф» (0 со () »о о

o o o o

o o o и (о

1-»

o o

o o

2

lE

3 (Д

Ц о

И

2 Ф о

6 о

tO (II о о о

v а г

О CD

К ч

° 1 е о о

СМ

О) о о

СО сО сО сб р с9 0) ф 1 ° ° о о о о

Ol

СО о о сО 01 сО Ф о о о о Ч

° (» . о о о

t» о о

Ol о о

c4 cg (О CO о о о о

Ф1 о о о о о

EQ (О (О юЧ 9"4 %"4 о о о

CD

CD о о

Е о

Ф сО о еЧ о о

m 3

" Фа ю у к8 о ®

Ц

4 s.

Р о

»»

A о

) о о

М

f Ф

tO о

+I о о о

° 4

К

03 о ж +! (О о

ll Д

+!

7393S 1

° ° о и

1.> о с

K ф

Ф

Я о

CD

С0 о о

Il

2.И

Ф

Ю

Ц

g 8 о о

+t

Ф

СО о п

73938

11 формула изооретения

Способ определения активности моноаминоксидаз в биойогическом материале путем обработки амина в слабоосновной среде инкубации избытком семикарбазида в присутствии моноаминоксидазы с после« дующей обработкой полученной смеси раствором трихлоруксусной кислоты, избытком 2,4-динитрофеницгидразина и измерением оптической плотности попученного раствора, отличающийся тем, 12 что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве амина испопьзуют серотонин или триптамин.

Источники информации прийятые во внимание при экспертизе

i. Gr åårI А.1.сед Haug %ton Т.М. Асо

5orimetvie rnehboh 1огеМ мИон ok тоооа юе оМбаве. Siocbemicat «оот

ОЫ,.4961,16,4й,р- 112-415 (прототип).

Составитель С. Хованская

Редактор N, Недолуженко Техред М. Петко Корректор М. Вигула

Заказ 3025/6 Тираж 1019, Подписное

ЦНИИ ПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 фипиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная. 4