Способ определения активности изоферментных фракций адеаминникотинамиддинуклеотидфосфатзависимой изоцитратдегидрогенозы

 

11,74О234

Союз Советскик

Социалистических

Республик (6l ) Дополнительное к авт. свнд-ву(51)М. Кл. (22) Заявлено -30,05,78 (2i ) 2622982/28-13 с присоединением заявки №. А 61 В 10/00

G 01 М 33/16

Гасударственные комитет

СССР (23) ПриоритетОпубликовано 15,06.80. Бюллетень № 22 по делам изобретений и открытий(53) УДК 616 074 (088.8) Дата опубликования опнсанйя 18 06 80

И. Я. Конь и JI. И. Ширина (72) Авторы изобретения с

Центральный ордена Ленина институт усовершенствования врачей (7I) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ИЗОФЕРМЕНТНЫХ

ФРАКЦИЙ АДЕНИННИКОТИНАМИДДИНУКЛЕОТИДФОСФАТЗАВИСИЯ ОЙ ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

1 . -Изобретение относится к области медицинской биохимии, а именно определению активности ферментов. . Известен способ определения активности изоферментных фракций аденинникотинамиддинуклеотидфосфат-зависимой изо5 цитратдегидрогеназы (А НАДФ-ИДГ) путем алектрофоретического разделения исследу-, емого материала в полиакриламидном ге ле с ледащей инкубацией геля и растко воре, содержащем феназинметасульфат и тетразолий, и определением отдельных изоферментных фракций по оптической плотности окрашенных зон геля (11.

Однако, атот способ. является недос» таточно чувствительным и не позволяет с достаточной степенью достоверности . судить об активности минорных изофер ментных фракций (1, 3, 4 и 5-й) и их изменениях при различных воздействиях, . а также требует длительной инкубации, необходимой для появления окрашивания.

Целью изобретения является повышение точности и ускорение способа.

Это достигается тем, что в инкубационную среду дополнительно вносят раствор ретинола или ретинил-ацетата в концентрации 2-3 мг/мл.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

С помощью зонального алектрофореза в полиакриламидном геле в стандартном аппарате для электрофореза осуществляют разделение изоферментов АНАДФИДГ.

Исследуемый материал (вместе с Сефадексом 6 -25} вносят с помощью пипетки в трубки, содержащие ступенчатый градиент геля (10% 7 5% 3 5%) в расчете на акриламид. В качестве концентрирующего слоя используют суспензито Софадекса - 200. Исследуемый материал вносят в трубку из расчета

2-3 мг белка на трубку. Электродным буфером служит раствор трис- НС1 буфера (рН 8,3; 0,5 N). Длительность электрофореза.составляет около 4 ч при силе тока 2 мА на трубку. Об окончании электрофореза судят по продвижению индика2

1, 42

2,50

0,130

0,085

0,660

0,041

16,7

3,8

3,2

0,037 0,180

0,040 0,200

4,8

- ° 5,0

Формула изобретения риала в полиакриламидном геле с последующей инкубацией геля в растворе, содержащем феназинметасульфат и тетразолий, и определением отдельных изоферментных фракций по оптической плотности окрашенных зон геля, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения

Способ определения активности изофер- 55 ментных фракций аденинникотинамиддинуклеотидфосфат.-зависимой изоцитратдегидро геназы (НАДФ-ИДГ) путем электрофоре- тического разделенйя исследуемого мате-

3 7402 Э4 4 торной краски-бромфенолового синего, Предлагаемый способ значительно по . Для очистки геля проводят предваритель вышает активность всех изоферментных ный электрофорез в режиме, соответству фракций НАДФ-ИДГ. При этом наиболее ющем режиму основного электрофореза. значитольно возрастает активность 1-й

После окончания электрофореза t"eJIH из- 5 (B cpagHelvf в 1 7 paG) H 5 Й фракции влекают из трубок,и помещают в пробир- (в среднем в 5 раз). Активность осталь.. вЂ--ки, заполненные инкубационной средой ных фракций (2,3,4-й) повышается в для BsIRMBHKsl активности НАДФ-ИДГ, . 3-.5 раз. При этом внесение в среду ви включающей 0,.05М глицил-глйциновый . тамина А позволяет в ряде случаев выябуфер рН 8,6 НАДФ 1 7 м y@P 5,„У . 10 вить активность так называемык миноР. NaCg 2 мУ, )ч пу 15 м)Ц . тринатрие ных (1, 3, 4 и 5-й) фРакции, не выЯв вую со,ь изолимонйой кислоты - . ляющуюся (или выраженную в черезвычайl р,015 м, нитросиний тетразолий но малой степени) при использовании

P,36 MM раствор ретинола или ретинил- известного способ . ацетата в концентрации 2-3 Mt /мл. Про-! бирки помещают в термостат и инкуби- При внесении в инкубациойную среду руют в течение 10 мин при 37 С. Затем витамина А развитие интенсивности ок. в каждую пробирку вносят феназинмета-. раски происходит уже на 10 - 20-й мисульфат в концейтрации 0,06 MM и инку- нутах инкубации, тогда как при использобируют пробы в течение 5-20 мин при о ванин существующего метода для разви. :той же температуре. Интенсивность окра- . тия выраженной окраски требуется не шивания в зонах локализации изофермент- .менее 30-40, а в ряде случаев и 60 мин, ных фракций регистрируют с помощью ден- ситометра. Активность йзоферментных . а ий НАдФ-ИдГ в аж т в словных 25 СРедние- РезУльтаты исследований по едц ицах оптич к и „н "сопоставлению определения активности ци, нальной пл, „и., „а,, изоферментных Фракций НАДФ зависимой площади окрашенных зон) в пересчете на 1 м. бе а в исСл . Изоцитратдегидрогеназы с помощью изе чете на мг елка в исследуемом вестного и предлагаемого способов приве при 37 С. - - . . - 30 пены в таблице. .

Источники информации, принятие во вниыание при экспертизе

1. Вестнйк АМН СССР, Ж 11, с.51, 1974,.

5 740234 точности и ускорения способа, в инкуба ционную среду дополнительно вносят раст вор ретинола или ретиннп-ацетата в конечной концентрации 2-3 мг/мл.

Составитель С. Малютина

Редактор Н; Потапова Техред Н. Бабурка КорректорС.:Щомак

Заказ 3072/4 . Тираж 673 Подписное

ПНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий . 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4