Способ определения функциональной полноценности почечного аллотрансплантата

 

<1 1,740236

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН Ия

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6l ) Дополнительное к авт. свнд-ву (22) Заявлено 07,06.78(21 ) 2628259/28-1 3 с присоединением заявки.%Союз Советских

Социалистических

Республик (51)М. Кд.

А 61 В 10/00

Гасударственный комитет

СССР (23) ПриоритетОпубликовано 15,06.80. Бюллетень № 22 до делам изооретеиий и открытий (53) УДК 616-074 (088. 8) Дата опубликования описания 18,06,80 (72) Авторы изобретения

P. Л, Розенталь, Э. Л. Букатова, В. В, Соболев и Г. Р, Эйдеман

Рижский медицинский институт (7I) Заявитель ./ (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ

ПОЛНОЦЕ ННОС:ГИ ПОЧЕЧНОГО АЛЛОТРАНСПЛАНТАТА

Изобретение относится к областй медицины и касается прогнозирования результатов трансплантации органов.

Известен способ определения функциональной полноценности почечного аллотрансплантата путем определения фермента в перфузате tl).

Однако известный способ не позволяет определить полноценность аллотран= то сплантатта до его пересадки.

Целью изобретения является определенйв пблноценности аллотрансплайтата дб его пересадки.

Эта цель достигается тем, что иссле» дуют активность глицинамидинотрансферазы в первых 9,5-10,5 мп перфузата и при активности фермента 0,157 0,151

МЕ трансплантат признают полноценным.

Для осуществления способа проиэво дят определение активности следующих ферментов: лактатдегидрогеназы (ЛДГ), аспартатаминетрансфераэы (АСТ), гли» цин-амидинотрансферазы (ГАТ) .

Обычными методами активность ферментов в первых 10 мл промывного раствора, получаемых непосредственно сразу после периода первичной тепловой ишемии при отмывании донорской почки или вообще не выявляетса или реакция идет не линейно, С целью концентрирования ферментов в укаэанные 10 мл промывного раствора добавляют сефадекс

-25 1г íà 10 мл. В этих условиях активность ферментов также не выявляется или реакция идет не линейно. Поэтому и проводят различные модификации, к промывочному раствору добавляют следующие реактивы в растворах цистеин в различных концентрациях (0,01 М; 0,05 М;

0,1 N); окисленный глутатион (0,01 М;

0,05 М; 0,1 М); 2-меркаптоэтанол (0,01%; 0,05%; 0,1%); трилон Б (001 М; 005 М; 01 М).

Активность ферментов определяют при значениях рН 7,0; 7,2; 7,4; 7,6; 7,7;

8; 8,0. При определении активности

ЛДГ используют различные буферы;

740236 триЬ-буфер, натрий-натриевый фосфатный и калийнатри евый фосфатный буферы, а также реакцию проводят при температу- ре 25, 32 и 37 С. При определении активности ГАТ дпя выявления образовавшихся микроколичеств аргинина применяют конценграции красителя 0,01%> 0,02%;

О, 03%Ф растворы 8-гидроксихинолина и 0,1%, 0,2%, 0,3% растворы гипобромита.

Оптимальными являются следующие варианты: для ЛДГ необходимо.концентрирование промывного раствора сефадексом Г-25, использование калий-натриевого фосфатного буфера с рН 7,4 при о

-32 С. Для АСТ - концентрирование, сефадексом Г-25, использование трилона Б. Для выявления активности ГАТ необходимо проводить инкубацию с буферно-субстратной смесью, содержащей

0,05% раствор 2-меркаптоэтанола и

0,05 N раствор трилона Б при рН 7,7.

Добавление к.буферно субстратной смеси отдельно глутатиона, или цистеина, или типона Б или их сочетаний (5 ва- 2 риантов) не позволяет выявить активность

I AT в тех же 1 О мл промывного раствора.

При выявлении оргинина лучшим сочетанием являются 0,03% ный раствор

8-гидроксйхинолина и 0,3%-ный раствор гипобромита.

Данные активности ферментов в промывном растворе, получаемом непосредственно сразу после периода первичной тепловой ишемии при отмывании донорской почки, сопоставляют с функциональной активностью почки после ее пересадки реципиенту. Активность лактатдегидрогеназы и аспартатаминотрансферазы не- 40 зависимо от того, когда наступала функция почки у реципиентов сразу на операционном столе(1), через 14-21 дней (I1), или почка не функционировала (T TI), была приблизительно одинакова: 4 функция у реципиента

0,3

0,6

0,03

7,2

0,1

1,2

0,3

7,2

0,01

0,2

0,02

0,1

4

4,05

0,157

И 6.

Х 0,01

0,012

О, 01

0,012

2,104

4, 05+

2,10

0,061

0,157

0,061 фЖ эйФ

Л ДГ,МЕ ХЬО+Ъ1 2М+51 232458

ДСт,М О -ОО5 ОЮ ООь си+о,ОДВ.

То есть активность этих ферментов не позволяет выявлять функциональную полноценность органа непосредственно после периода первичйой тепловой ишемии.

Исследование активности глицинамицийотрансферазы выявило определеннув коррозшо между функциональной полноцен- . ностью органа и активностью фермента, ч3: определяемого непосредственно после пе= риода первичной тепловой ишемии при за-.

° I боре донорской почки. Если в первых

10 мл промывного раствора, вытекающе> го из почечной вены при первичной перфузии консервирующим раствором непосредственно сразу после периода первичной тепловой ишемии, активность I AT была равна О - 0,03МЕ (в среднем 0,01 .

10 О, 012), аллотрансплантат у реципиента начинал функционировать на операционном столе; если активность в среднем составляла 0,15740,061 МЕ, трансплантат функционировал на 14-21 день; если же ак)

15 тивность ГАТ в среднем составляла

;4,05ф2,104 МЕ, то трансплантат вообще не функционировал.

В таблице представлена активность глицерин-амидинотрансферазы в перфу20 вате непосредственно после периода пер,вичной тепловой ишемии в сопоставлении с функцией пересаженной почки у реципиента.

Как видно из таблицы„ если активность ГАТ в промывном растворе не пре-, вышала в среднем 0,01 0,012 МЕ, функция почки у реципиента наступала на операционном столе, если же активность

ГАТ была 0,157 0,061 МЕ, то функция у реципиента была на 14-21 день, если

74023 же активность была 4,05+2,104 МЕ, то почка не функционирована вообще. Таким образом, при активности ГАТ в промывном растворе не превышающей 0,3 NE, трансплантат можно считать функционально полноценным, Пример . При первичной перфузии во время забора почки у донора непосредственно после периода первичной тепловой ишемии из почечной вены соби- g рают вытекающую жидкость в количестве 10 мл, прибавляют 1 r сефадекса

Г-25 и центрифугируют на рефрижераторо ной центрифуге при1400 д и 4 С в течение 30 мин. 15

Надосадочную жидкость отсасывают и вносят по 0,2 мл в 2 пробирки: опыт и контроль. В контроль для осаждения белков добавляют 0,1 мл 30%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Затем в 2п обе пробирки приливают по 0,7 мл буферно-:субстратной смеси, приготовлен-. ной на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,7 (содержащей растворы 0,007M орнитина, 0,007М канаванина 0,05% 2-меркапто- 25 этанола 0,05 М трипона Б).

Обе пробирки инкубируют в течение

1 ч при 37 С в термостате. Для осаждения белков в опытные пробирки прибавляют 0,1 мл 30%-ного раствора трихлорук-30 сусной кислоты.

Все пробирки центрифугируют при

14 О О д в течение 1 5 мин. Затем отсасывают 0,5 мл насадочной жидкости и

«помещают в другие пробирки, прибавляют по 2,5 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,03%-ного 8»гидроксихинолина и 1 мл

0,3% раствора гипобромита, смешивают и фотометрируют при длине волны 490нм анализ против контроля на СФ-1 6 или на ФЗК-56М. Активность ГАТ выражают в международных единицах.

При активности фермента в промывHGM растворе не превышающей 0,3 МЕ трансплантат считают функционально полноценным.

Предлагаемый способ позволяет достаточно прогнозировать полноценность почечного амортрансплантата и избежать пересадки неполноценного органа.

Формула изобретения

Способ определения функциональной полноценности почечного аллотрансплан-, тата путем определения фермента в перфузате, отличающийся тем, что, с целью определения полноценности аллонтрансплантата до его пересадки, исследуют активность глицин-амидинотрансферазы в первых 9,5-10,5 мл пер фузата и при активности фермента

0,157ф0,151 МЕ трансплантат призна ют полноценным, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Uto(.)at, 1975, 30, р.362-368, Состааик .ыь:С. Малютина

Редактор Н. Потапова Техред М. Петко Корректор Ю. Макаренко

Заказ 3072/4 Тираж 673 Подписное

Ш-1ИИПИ. Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектйая, 4