Стабилизированный состав для определения мочевины, содержащий уреазу

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (6) ) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 150277 (21) 2453752/23-04 (23) Приоритет — (32) 25. 03. 76 (3I ) Р 26 12 726. 4 (83) ФРГ

Опубликовано 25.06,8(1 Бюллетень Ж 23

Дата опубликования описания 250680

Соуп Советских

Социалистических

Республик

< >743600

1 ( (51) М. Кл.

G N 31/22

С 07 G 7/02

/ -р с- ф мi ) l (pJ Ma ôß с- fd Qila 3 (53) УДК577. 15. 07 (088. 8) Государстаениый комитет

СССР по делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Вальтер Шнайдер, Альберт Редер, Ханс Иеллеринг, Ингеборг Гутманн (ФРГ) Иностранная фирма Берингер Ь)аннхайм ГмбХ (ФРГ) P1) Заявитель (54) СТАБИЛИЗИРОВАННЫЙ СОСТАВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЧЕВИНЫ, СОДЕР%МЦИЙ УРЕАЗУ

Изобретение относится к стабилизированным составам на основе уреазы, которые находят применение при определении мочевины.

Энэим уреаза расщепляет мочевину с образованием угольной кислоты и аммиака. Характерной особенностью этого энзима является то, что в сыром состоянии уреаза черезвычайно стабильна при хранении, стабильность же очищенной уреазы .сильно падает и уже при удельной активности приблизительно от 25 до 100 U/ìã является неудовлетворительной °

Обычная продажная уреаза с удельной активностью около 100 U/ìå при полугодовом хранении теряет в холодильнике уже около 50% своей активности. Хранение при комнатной температуре или в растворенном виде приводит к еще более быстрой потере активности.

Попытки повысить стабильность очищенного энзима в результате изменения значения рН буфера, ионной силЫ и типа буфера (малеат, цитрат, этилендиаминтетрауксусная кислота, фосфат) или в результате создания составов на основе уреазы, содержащих помимо энзима соединения с сульфгидрильными группами, такие как цнстенн или меркаптоэтанол, оказались безрезультатными.

Определенного небольшого повышения

6 стабильности удалось добиться с помощью состава, содержащего помимо уреазы дважды перекристаллизованный альбумин плазмы быка (1).

Однако достигаемая степень ста10 бильности оказалась недостаточной для использования этого состава, что было обусловлено относительно быстрым разрушением знзима и падением его активности.

l5 Цель изобретения — повышение стабильности. указанная цель достигается, согласно изобретению, составом для определения мочевины, который помимо

ЯО уреазы содержит смесь глутатиона, этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и тринатрийцитрата в кристаллической форме, содержащего 2 молекулы кристаллизационной воды, прн

RS e oT eHHH M oHeHTo уреазаг глутатион, этилендиаминтетрауксусная кислота: цитрат 1: (1-3): (13) г (1-3) .

Предлагаемый ст абилизированный

ЭО состав содержит уреазу, предпочти743600 тельно предварительно обработанную сефадексом.

Обработкой сефадексом удается почти удвоить активность энзима и стабильность препарата, Не поддаюшиеся стабилизации примеси в результате этой обработки удаляются, так что препарат уреазы на основе описываемого стабилизирующего состава отличается особенно высокой стабильностью после добавления смеси стабилизаторов. Обработку сефадексом можно производить как в результате однократного введения,сефадекса в раствор энзима, так и на колонке.

Предпочтительно применение сшитого сефадекса со свойствами молекулярных сит, так как при этом одновременно достигают обессолив анне уреаэы наряду с обогашением и удалением мешаюших примесей.

Отличиями предлагаемого состава являются наличие в нем помимо энэима глутатиона, этилендиаминтетрауксусной кислоты .(ЭДТА) и кристаллогидрата тринатрийцитата, а также соотношение компонентов соответственно 1:(1-3):(1-3):(1-3).

Неожиданным оказался стабилизируюший эффект смеси названных трех веществ (глутатион, ЭДТА, цитрат), хотя известно, что отдельные составные части этой смеси не обладают стабилизирующим действием.

Предлагаемый стабилизированный состав, содержаший уреазу, полученный после лиофилизации смеси после

12-недельного хранения при 33 С, практически полностью стабилен и показывает 100% активности по сравнению с исходной.

Сам энэим после лиофилизации теряет активность от 30 до 80%.

Стабилизированный, согласно изобретению, состав, содержаший уреазу, применяется для определения мочевины, Он является таким устойчивым, что пригоден для пропитки бумаги, пленки и тому подобных материалов-носителей или для получения реакционноспособных слоев на такого рода носителях.

Если такого рода носитель или такого рода слой дополнительно содержит индикатор рН, то мочевину можно определить путем однократного изменения окраски.

Пример 1. 30 мг обычной продажной уреазы с удельной активностью около 100 U/ìã растворяют в 1 мл воды, пропускают через 5 мл геля сефадекса G-50, предварительно уравновешенного цитратным буфером рН 7,0, соцержашим 0,5% 2-меркаптоэтанола, и непосредственно после этого лиофилизируют. Лиофилизированный препарат подвергают затем испытанию на стабильность в результате хранения при 33 С.

Во второй колонке повторяют описанный выше опыт, в котором к энэиму, обработанному сшитым сефадексом

G-50, добавляют глутатион, цитрат и ЭДТА в весовом соотношении 1:1:1:1.

Затем повторяют лиофилизирование и хранение, как описано в первом опыте, Составные части хорошо перемешивают и добавлением 1 н. раствора

HCl доводят значение рН до 6,0. Массу наносят на поливинилхлоридную пленку и высушивают в течение 60 мин при

60 С. Прикапывают мочевинусодержашую кровь или сыворотку и после стирания ее через 9 0 с проявляется следующая окраска: 20 мг % мочевины— желтый, 60 мг % мочевины — желто-зеленый, 100 мг % мочевины — зеленый, 200 мг % мочевины — темно-зеленый.

d0

В случае первого опыта без добавления стабилизирующего средства выход активности после лиофилизации со,ставляет 20%. После 6-недельного хранения при 35 С замеренная остаточная активность составляет менее 1%.

Во со стабилизируюшим средством, согласно изобрете15 нию, активность после лиофилиэации составляет 100%. Через 3 месяца активность также составляет 100%.

Пример 2. 150 мг обычной продажной уреазы с удельной актив3() ностью около 100 U/мг растворяют в 100 мл воде, смешивают с 150 мг глутатиона, 150 мг цитрата и 150 мг

ЭдТА в весовом соотношении 1:1:1:1 и без обработки сефадексом лиофилиэируют. В лиофилиэате определяют исходную активность. Она составляет 100%.

Лиофилизат подвергают затем хранению при 33 С. После 6-недельного хранения активность составляет еше

95% исходного значения.

Пример 3. Иэ обычной продажной уреаэы в результате многократной кристаллизации иэ ацетон-цитратного буфера и обработкой сефадексом полу35 ч,ют уреазу с удельной активностью около 1500 U/ìã. Полученный препарат (10 мг) смешивают с 30 мг глутатиона, 30 мг цитрата и 30 мг ЭДТА в весовом соотношении 1:3:3:3. Устойчи40 вость при хранении при 33 C соответствует уреазе 100 U/ìã.

Пример 4. Испытательная пленка для определения мочевины (в крови или сыворотке). Составные части: порошкообразный поливинилацетатпропионат 45,0 r, 1,93%-ный раствор натрийальгината в воде 10,0 г диокстилнатрий-сульфосукцинат 0,5 г, стабилизированная уреаэа (1: 1: 1:1) плюс растворенный в воде (в 10 мл) бромтимолбляу, растворения в 5 мл метанола, плюс 5 мл воды (10000 U), 0,25 r динатрийгидрофосфат 0,9 г.

743600

Формула изобретения

Составитель О. Скородумова

Редактор Т.Иванова Техред Р.Олиян Корректор В.Бутяга г

Заказ 3517/53 Тираж,10 19 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная,4

После 3-дневного хранения при

60 С эта испытательная пленка реагирует практически неизменной.

Испытательная пленка этакого же состава и изготовления, но которая содержит вместо стабилизированной, согласно изобретению, уреазы нестабилизированную уреазу такой же активности, первоначально показывает практически такую же окраску при реакции, однако после хранения в течение 3 дней при 60 С более не пригодна, 1. Стабилизированный состав для определения мочевины, содержащий уреазу, о т л и ч а ю m н и с я тем, что, с целью повышения стабильности, он дополнительно содержит смесь глутатиона, этилендиаминтетрауксусной кислоты и тринатрнйцитрата в кристаллической форме, содержащего 2 молекулы кристаллизационной воды, при следующем соотношении компонентов уреаза: глутатион, этилендиаминтетрауксусная кислота: цитрат 1:(1-3):(1-3).:(1-3) .

2. Способ по п,1, о т л и ч а ющ н .й с я тем, что уреаза предварительно обработана сефадексом.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

5 1. ЬУ К,R, Some Preperties

and Purifications of Urease, Biochimica et Biophys1ca Acta

1967, 146, р.205-218 (прототип).