Транс-2,3,11,12-(4,4-диамил)- дибензо-18-корона-6 в качестве избирательного индуктора калиевой проницаемости биологических и искусственных мембран

 

ОП И С АНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

<„,763344

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 27. 04. 78 (21) 2609466/23-04 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет—

Опубликовано 150980. Бюллетень Мо 34

Дата опубликования описания 15,0980 (51)М. Кл.

С 07 0 323/00

A 61 К 31/335

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) 4Ê 547.841 (088.8) Б.А.Ташмухамедов, A.È.Ãàãåëüãàíñ, A.Â.Øêèíåâ,Ó.З.Мирходжаев, А.К.Ташмухамедова и Н.Ж.Сайфуллина (72) Авторы изобретения

Институт биохимии AH Узбекской ССР и Институт биоорганической химии AH Узбекской CCP (71) Заявители (54 ) ТРАНС-2, 3, 11, 12- (4, 4 -ДИАМИЛ)—

ДИБЕНЗО-18-KOPOHA-6 В КАЧЕСТВЕ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО

ИНДУКТОРА КАЛИЕВОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ

БИОЛОГИЧЕСКИХ И ИСКУССТВЕННЫХ МЕМБРАН

Изобретение относится к новому химическому соединению — транс-2,3, 11,12-(4,4 -диамил)-дибензо-18-корона-б, которое может найти применение в биологии и медицине в качестве избирательного иднуктора калиевой проницаемости мембран.

Известны природные индукторы ионной проницаемости мембран, в частнос-10 ти антибиотики группы нактина, валиномицин, грамицидин (1j.

Однако природные ионофоры, несмотря на ряд преимуществ, химически малоустойчивы и труднодоступны. 15

Известны также синтетические ионофоры — диацильные производные

2,3,11,12-18-короны-б, в частности транс-2,3,11,12-(4,4-дивалерил)-дибензо-18-корона-б 21 . 20

Указанное соединение является преимущественно индуктором проницаемости биологических мембран по двух + 2Ф валентным катионам (Са, Мд ), а кроме того, характеризуется низкой избирательностью по отношению к иону калия, индуцирует транспорт ионов только через биологические мембраны, менее активен по действующей концентрации (в 100 раз) и плохо раство- З0 рим в спирте, что ограничивает сферу его применения.

Новое соединение — транс-2,3,11, 12-(4,4 -диамил)-дибензо-18-короны-6 общей формулы 1,способное эффективно и избирательно увеличивать калиевую проницаемость как биологических,так и искусственных мембран подвергают восстановлению по Клемменсону.

Структура полученного соединения доказана данными ИК-, ЯМР и массспектроскопии.

Синтезированное соединение формулы. 1 способно давать комплексы с ионами щелочных металлов и избирательно индуцирует транспорт ионов калия как через биологические, так и искусственные мембраны.

Пример 1. Синтез транс-2,3, 11,12-(4,4 -диамил)-дибензо-18-коро1 ll ны-б.

Берут 1 г транс-2,3,11,12-(4,4 дивалерил)дибензо-18-короны-б, 1,3 r амальгамированного цинка, 2,4 мл концентрированной соляной кислоты, 0,5 мл воды и 50 мл этилового спирта, кипятят в течение 40 ч, добавляя каждый час по 0,2 мл концентрирован ной соляной кислоты, смесь декан763344 тируют с непрореагировавшего цинка и отгоняют спирт, добавляя воду.

Выделившееся масло экстрагируют хлороформом, промывают водой до нейтральной реакции, сушат СаСВ и растворитель удаляют. 5

Продукт реакции очищают колоночной хроматографией в системе гексанхлороформ-ацетон — 3:2г0,5 и последовательной кристаллизацией иэ гексана и ацетона. Выход 0,5 г (53%), т.пл.111-113 С.

Найдено, % С 72,18; Н 9,24, M.â.500)

44 Ь"

Вычислено,% С 71 97 ° Н 8р86; 1

N.Â. 500,6.

ЯМР-спектр (м.д.): 6,5-6,8 (6Н,м, АгН); 3,8-4,2 (16Н,м,,ОСН ); 2,48 (4Н,T,-СН ); 1,00-1,70 (12Н,м,С-СН );

0,82 (6Н,Т, С-СНэ).

ИК-спектр, см : 15 95,1520 (=CH);

2950-2870, 1270-1150 (-С-О-С-); 870, 810 (1,2,4 — замещенный бензол).

Пример 2. Специфику проницаемости, индуцируемой транс-2,3,11,12(4,4 -диамил) -дибензо-18-короной-6 на 25 биологических и искусственных мембранных системах, исследуют на митохондриях и бислойных фосфолипидных мембранах (БФМ), которые являются классическими объектами для тестирования 30 мембраноактивных свойств различных соединений.

Митохондрии печени крыс выделяют методом дифференциального центрифугирования. Проницаемость внутренних. 35 мембран этих субклеточных органелл определяют по скорости снижения оптической плотности суспензии при 520 нм на фотометре ЛМФ-69, к выходу которого подключали самописец ОН-102. Изме- 4О рения проводят при перемешивании в стеклянных кюветах с длиной оптического пути 1 см. Инкубационные среды объемом 3 мл содержат во всех случаях ингибиторы дыхания — ротенон и антимицин (по 0,33 мкг/мл) и 10 мм трис- 45 нитрата (рН 7,45); кроме этИх компонентов среды содержат 130 мм нитрата калия или натрия, либо аммония (при измерении проницаемости по Н ), или

86 мм нитрата кальция, или магния или 50 бария.

Таким образом, энергозависимое на-. бухание митохондрий, обладающих свойствами осмометров, лимйтируется только скоростью трансмембранного переноса исследуемого катиона, поскольку нитрат является анионом, IIpoHHKBHNgHM через мембраны митохондрий. Использованные препараты этих органелл характеризуются .низкой проницаемостью по 4() всем катионам, исключая Са, который

Я+ транспортируется внуть митохондрий с высокой скоростью при помощи специфи ческого зндогенного кальциевого пе носчика.

Проницаемость для различных катионов оценивают по скорости набухания митохондрий, которую измеряют.в

Ь Е /мин. В кювету со средой инкубации добавляют митохондрии (1,1-1,2 мг белка на 3 мл среды) и регистрируют скорость уменьшения оптической плотности в течение 1 мин. Затем в кювету вносят в зависимости от исследуемой концентрации 15-150 мкл спиртового раствора циклополиэфира и продолжают регистрацию еще 2-3 минуты. Контролем служат пробы, в которые вносят только соответствующий объем эталона.

Результаты исследований показывают (табл.1), что транс-2,3,11,12-(4,4 .диамил)-дибенэо-18-корона-6 в низких концентрациях (2,5 «10 -1«1О М) индуцирует проницаемость митохондриальных мембран преимущественно для ионов К, в меньшей мере — для Н и Na, не действуя даже при использовании существенно более высоких концентраций (5-10 10 М) на скорость переноса цвухвалентных катионов. В присутст-б вии 1«10 M соединения 1 проницаемость митохондрий по Na увеличивается в

1,3 раза, по Н+- в 2 раза, в то время как по К+ — в 20 раз. Более высокие концентрации циклополиэфира (1"10 - 1 10 N) индуцируют общее увеличение проницаемости митохондрий для одновалентных катионов, однако проницаемость по К, по-прежнему, остается в несколько раэ выше, чем для Н и Na . Так, относительная проницаемость митохондрий для калия, водорода и натрия индуцированная

1«10 N транс-2,3,11,12(4,4" -диамил)— дибензо-18-короной-6 составляет соответственно 1,0,46 и 0,075 (прирост проницаемости для калия принят эа 1).

С увеличением концентрации соединения 1 в диапазоне 2,5"10 — 1 1б5M калиевая проницаемость мембран митохондрий увеличивается линейно.

Таблица 1

Влияние различных концентраций транс-2,3,11,12-(4,4 -диамил) -дибензо-18-короны-6 на проницаемость мембран митохондрий для некоторых одно- и двухвалентных катионов (A — проницаемость в присутствии циклополиэфира, Ag — KoHTpozxe)

0,25 4,7 1 0 1,0 1,0 1,0 1,0

0,5 7,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

763344

;Продолжение

0,75 10,7 1,0 1,1 1,0 1,0 1,0

1,0 20,0 1,9 1,3 1,0 1,2 1,g

5,0 42,4 15,6 2,5 1,0 1,8 1,g

80,0 36,7 6,2 1,1 2,8 1,0

49,8 14,6 0,5 2,8 1,0

10,0

50,0

100,0

0,5 1,7 1,0

Эффекты, оказываемые синтезированным циклополиэфиром, на митохондриях, коррелируют с данными, полученными на бислойных фосфолипидных мембранах. БФИ из липидов белого вещества мозга быка формируют на отверстии диаметром 1 мм в тефлоновом стаканчике, помещенном в стеклянную кювету с буферным .раствором: 25 мм трис-HCE (pH 7,4). Мембранообразующий раствор содержит 20 мг фосфолипидов мозга в 1 мл декана. Параметры

БФМ измеряют при помощи хлорсеребряных электродов, подключенных к электрометру OP-205.

Эксперименты, выполненные на БИФ

It показывают, что транс-2,3,11,12-(4,4диамил)-дибензо-18-корона-б индуцирует проводимость бислоев, состоящую из калиевой и протонной ко:.депоненты.

При использовании 5 10 М синтезированного циклополизфира проводимость

БФМ по Н увеличивается в 2,5 раза, а по К+ — в 7,5 раз, т.е. имеет место общее снижение сопротивления в 10 раз.

При создании на мембране 10-кратного калиевого градиента генерируется мембранный потенциал, равный 58 мВ, т.е. циклополиэфир придает фосфолипидной мебране свойства калиевого электрода. Вместе с тем, даже при использовании соединения 1 в концентрации 1 10 М не наблюдается индукции проводимости бислоев для ионов кальция. Катионную специфичность предла- гаемого соединения.по ионам калия или натрия оценивают путем добавления с одной стороны БФМ 10 мМ К

Ф а с другой — 10 мМ Na . B присутствии 1>10, М транс-2,3,11,12-(4,4 диамил)-дибензо-18-короны-б в этих условиях на мембране генерируется разность потенциалов, равная 59 мв.

Отсюда следует, что константа катионной специфичности К, Na равна 10.

Пример 3. Эффективную концентрацию транс-2,3,11,12-(4,4н -диамил)-дибензо-18-короны-б, индуциру

trave калиевую проницаемость, определяют на биологических мембранах (митохондрии) и модельных системах(липосомы и БФМ). Проницаемость митохондрий и БФМ по К измеряют как и в примере 2. Липосомы готовят из 10% спиртового раствора яичного лецитина путем его диализа против водного раствора, содержащего 30 мМ КСВ и 30 мМ трис-хлорида (рН 7,4) с трехкратной сменой буфера в течение 24 ч. Кинетику выхода ионов калия из липосом регистрируют с помощью стеклянного электрода ЭСЛ-51Г-04 в комплексе с лабораторным рН-метром рН-340, к выходу которого подключают самописец

КСП-4. Шкалу регистратора калибруют раствором КСВ известной концентрации

Данные, представленные в табл.2,показывают, что существует прямая пропорциональная зависимость между используемой концентрацией циклополи20 эфира и индуцируемой им калиевой про.ницаемостью на всех исследованных объектах. 5-10-кратное увеличение проводимости по К+ достигают добавлением к мембранным структурам предлагаемого соединения в конечной концентрации 5I10 М, что в 100 раз меньше концентрации, в которой проявляются мембраноактивные свойства его прототипа.

Таблица 2

Эффект различных концентраций транс-2,3,11,12-(4,4 -диамил)-дибензо-18-короны-6 на калиевую проницаемость митохондрий, липосом и бислойных фосфолипидных мембран

40

45 0

4,0

0,1

4,0

19,0

0,25

0,5

28,0

0,75

43,0

80,0

170,0

320,0

55 1,0

75

130

5,0

600

10,0 бО

Представлена проводимость БФМ в присутствии 10 мМ К

На основании полученных результатов транс-2, 3, 11, 12- (4, 4" -диамил) -ди65 бензо-18-корона-6 является избира763344

С5Н11

Составитель И.Дьяченко

Редактор Н.Горват Техред Н.Граб Корректор Г.Решетник

Заказ 6572/9 Тирам 495 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035> Москва, З-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 тельным индуктором калиевой проницаемости всех типов мембран, в 100 раэ активнее известных (2) по действующей концентрации, хорошо растворим в сптрте, в связи с чем более удобен для исследования на биологических объек- тах и может быть использован в качестве инструмента при изучении механизмов транспорта ионов калия через в качестве избирательного индуктора калиевой проницаемости биологических и искусственных мембран.

Источники информации, принятые во внимание при экспертиэЕ биологические и искусственные мембраны, а также для изготовления на его основе калий-чувствительных электродов для измерения активности ионов калия в жидких средах.

5 Формула изобретения

Транс-2,3,11,12-(4,4 -диамил)-ди1 I t янэо-18-yogioHa-6 формулы 1:

1. Овчинников Ю.A., Иванов В.T., Шкроб A.Õ. Мембраноактивные комплексоны . М., "Наука", 1974.

2. Авторское свидетельство СССР по заявке 9 2393378/23-04, кл. С 07 0 323/00, 02.08.76;