Способ культивирования вирусов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

< 764390

I (61) Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено 240179 (21) 2718808/28-1 (51)М. Кл.

С 12 N 7/00 с присоединением заявки Нов

Государственный комитет

СССР но делан изобретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 230781. Бюллетень N9 27 (- З) НЖ 576. 8.093.

° 1(088 ° 8 ) Дата опубликования описания 2 30 7.81 (72) Авторы изобретения

Л.Л. Миронова, Н. Е. Гольдрин, В. П. Грачев, Т.М.Орлова и В.И.Чернышев (71) Заявитель

Институт полиомиелита и вирусный энцефалитов

ANH СССР (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ

Изобретение относится к микробиологической промышленности „а именно культивированию вирусов.

Известен способ культивирования вирусов путем размноженйя их на линии диплоидных клеток t 1) .

Однако известный способ является малодоступным, кроме того линии клеток высоко чувствительны к определен- 1О ным питательным средам и сывороткам. цель изобретения — упрощение способа.

Это достигается тем, что вирусы размножают на линии диплодных клеток кожи и ьыац эмбриона зеленой мартыаки 5018 °

Полученная линия диплодных клеток кожи и мышц эмбриона зеленой мартышки 5018 имеет следующие бирлогические, генетические и морфологические характеристики.

Культура состоит из фибробластоподобных клеток. Морфология клеток остается стабильной s течение фазы активного роста.

Клетки легко снимаются со стекла раствором трипсина, хорошо растут на среде МЭМ с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Коэффициент развивки достигает величины 1 : 2, 1 : 3, 1: 4. При субкультивировании клеткй быстро прикрепляются к стеклу и на

3-4 сутки образуют монослой.

Клетки имеют ограниченное время жизни вне организма, до 57 пассажа, на протяжении фазы активного роста не теряют своих генетических свойств.

При кариологическом анализе установлено, что на уровнях 10,20,30 и 40 пассажей модальный класс составляли клеткй с диплоидным набором хромосом (2п - 60) . Число диплоидных клеток на протяжении фазы активного роста колебалось от 80, 3% до 85,5%, гипоплоидных 3,0 - 4,3, гиперплоидных-.

1,3 - 2,0. Хромосомы обследованных диплоидных клеток не отличались от хромосом, характерных для самца афри-канской зеленой мартышки. Корреляции между уровнями различных отклонений не отмечено. При сравнении хромосомных наборов на разных уровнях пассажей различий не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии контаминации линии другими клетками. Различий также не выявлено в рисунке дифференцированности хромосом по длине при окраске по Гимза, что свидетельствует о генетической стабильности культуры.

764390

При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезьян его титр равен 7,5 fg БОЕ/мл.

Пример 2. Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина П типа.

Клетки линии 5018 на уровне 8 пассажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере I. Титр вируса равен 7,3 Qg БОЕ/мл. При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезьян его титр равен 7,4 tg БОЕ/мл.

Пример 3, Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина

III типа, Клетки линии 5018 на уровне 8 пассажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере 1.Титр вируса равен 7,2 fg БОЕ/мл. При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезьян его титр равен 7,5 Рд БОЕ/мл.

Пример 4. Способ культивированйя вирусов из группы ECHO.

Клетки линии 5018 получают по методу, описанному в примере 1.При заражении вирусами среду из культуральных сосудов сливают, клетки промывают раствором Эрла и вводят 1 мл неразведенной культуральной жидкости, собранной после заражения определенным типом вируса первичной культуры клеток почек обезьян. Для адсорбции вируса культуры выдерживают при 37О С s течение 1 ч при постоянном покачивании, после этого добавляют поддерживающую среду . Культуры инкубируют при 37ОC до развития цитопатического эффекта. Сбор вируса проводят через

5-7 дней после заражения и определяют его титр.

Параллельно аналогичным способом заражают первичную культуру клеток почек обезьян. Во всех случаях в клетках линии 5018 вирусы нз группы

ЕСНО размножаются более активно: для вирусов ECHO 3-5, 11,13 титр составляет 10 . по сравнению с 10 о,ECHO

6, 19 — 10 и 10 ьо, ECHO 20

10 -6o и 10 и 10 to ТЦД6о/мл..

Пример 5. Способ культивирования пенящего вируса обезьян.

Клетки линии 5018 на уровне 15 пассажа отделяют от стекла по методу описанному в примере 1, и эксплантируют в литровую роллерную бутыль в количестве 60 ° 10 6 клеток. Культуру инкубируют при 37 C,во вращающемся состоянии со скоростью 18 об./ч в течение 24 ч до момента формирования монослоя, При заражении вирусом среду из культуральных сосудов сливают, клетки промывают физиологическим раствором и вводят вирус иэ расчета

10 ТЦД5О/мл.в объеме 30 мл поддерживающей средЫ. Вращательным движением вируссодержащую жидкость равномерно распределяют по монослою. Адсорбцию. Иэоферментная характеристика клеток линии в отношении лактадегидрогенаэы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы подтвердила идентичность их клеткам обезьяны.

Клетки линии 5018 не контамированы бактериями, грибами и микроплазмами.

Посторонние вирусы не выявлены ни в культуральной жидкости, ни в клетках.

Тесты на онкогенность также были отрицательными . 1О

По мере размножения клетки замораживают на различных уровнях пассажей для хранения в жидком азоте, таким образом создают их банк. При восстановлении сохраняют жизнеспособность на 80-85% . 15

Клетки линии чувствительны к различным вирусам: группы ЕСНО,полиомиелита, кори,,пенящему и цитомегаловиРУсу обезьян.

Характер цитопатических изменений 20 под действием вируса полиомиелита штаммов Сэбина по морфологии и срокам развития не отличается от наблюдаемого в первичной культуре клеток почек зеленых мартышек, используемых 5 для изготовления вакцины против полиомиелита.

Некоторые вирусы из группы ECHO типы 3-6,11,13,15,19,20, симпластообразующий вирус обезьян на клетках линии 5018 размножаются более активно, чем на первичных культурах клеток почек обезьяй, и также с характерным цитопатическим эффектом., Приводятся примеры культивирования вирусов на линии диплоидных клеток кожи и мышц зеленой мартышки 5018.

Пример 1. Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина 1 типа.

В матрасную колбу с диплоидными 40 клетками кожи и мышц эмбриона зеленой мартышки 5018 на уровне 7 пассажа вводят 0,25%-ный раствор трипсина, подогретый до 37 С . Через 10 с трипсин удаляют, а сосуд с клетками поме- 45 щают в термостат при температуре 37 С на 2 мин. Затем отслоившиеся клетки ресуспендируют в среде роста - среду

MEM.ñ 10% сыворотки крупного рогатого скота, и раэлива1от на две матрасные колбы. Эти культуры 8 пассажа инкубируют при 37 iC, в течение 4 суток до момента формирования сплошного слоя.

При заражении вирусом среду из культуральных сосудов сливают, клетки трижды промывают раствором Эрла и вводят вируссодержащую жидкость из расчета .2 БОЕ на клетку. Затем добавляют поддерживающую среду, в качестве которой используют среду NEN.Ин- 46 фицированные культуры инкубируют при

34 С . Сбор вируса производят на 4 день после заражения и определяют его титр по методу образования бляшек.

Титр равен 7,4 БОЕ/мл.

764390

Формула изобретения

Составитель Г. Смирнова

Редактор Т. Колодцева Техред Т. Маточка Корректор М.Пожо

3 аказ 5 769/40 Тираж 528 Под пи с ное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1130 35, Москва, Ж-35, P аушская наб., д. 4/5ж, Филиал ППП "Патент", г. ужгород, ул. Проектная, 4 вируса проводят при 37 С в течение

1 ч при постоянном вращении ° Затем вируссодержащую жидкость удаляют, а в сосуд вносят 100 мл поддерживающей среды с 1 5 сыворотки телят. Культуры помещают в барабан и вращают с той 5 же скоростью при 37 С в течение 4 дней, После этого проводят сбор вируса с последующим титрованием по развитию цитолатического эффекта. Его титр рав ен 10 ТЦД, /мл. 30

Параллельно вирусом заражают первичную культуру клеток почек обезьян в матрасной колбе, находящейся в стационарном положении. Вирус в ней размножается до титра 10 ТЦД о/мл, Пример 6. Способ культивирования цитомегаловируса обезьян.

Клетки линии 5018 на уровне 20 пассажа культивируют по методу, описанному в примере 1.

При заражении вирусом среду из 20 культуральных сосудов сливают и вводят неразведенную вируссодержащую жидкость, собранную со спонтанно зараженных цитомегаловирусом культур клеток почек эмбриона на зеленой мар- 25 тышки, в количестве 1 мл. Адсорбцию вируса проводят при 37 C в течение

1 ч. После этого добавляют поддерживающую среду. Культуры инкубируют при

37 с в течение 5 дней. После этого проводят сбор вируса с последующим титрованием по развитию цитопатического эффекта, титр которой равен 10

ТЦД /мл, В первичных культурах клеток почек зеленых мартышек вирус размножается менее активно и достигает титра

10- ТЦД о/.

Предлагаемый способ позволяет увеличить количество субстратов, используемых для культивирования вирусов, в, частности; применение для культиви-, рования вирусов нового субстрата, об-. ладающего стабильными биологическими, генетическими и морфологическими характеристиками в стадии активного роста, не обладающего онкогенностьв, легко культивируемого и являющегося чувствительным ко многим вирусам.

Линия диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона зеленой мартышки отличается легкостью получения и субкультивирования. При использовании ростовой среды МЕМ с добавлением 10 Ъ сыворотки крупного рогатого скота не требует особых видов питательных сред и дефицитной эмбриональной сыворотки .телят, обладает устойчивыми морфологическими, биологическими и генети.ческими особенностями. Она чувствительна ко многим вирусам, что открывает перспективы широкого использования в вакцинном производстве. Ее клетки хорошо сохраняются в жидком азоте.

Использование ликии в производстве вакцин позволит снизить импорт обезьян и готовить большие партии вакцин на стандартном клеточном субстрате.

Способ культивирования вирусов путем размножения их на линии диплоидных клеток, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, вирусы размножают на линии диплоидных клеток кожи и мжщ эмбриона зеленой мартышки 5018.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Патент США Р4040905,кл 195/18 (C 12 К 9/00), 1971.