Способ получения модифицированных ферментов

 

Й -,: . Л сЖЙЫ1, ) ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскик

С оциалистическии

Республик (t>) 767120 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22).Заявлено 13р276 (23) 2429264/23-04 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет (5f)V. Кл з

С 07 Я 7/02

A 61 К 37/48

Государствеииый комитет

СССР яо делам изобретеиий и открытий

Опубликовано 300980, Бюллетень № 36 (53) УДК:577. 15. .07 (088.8) Дата опубликования описания 300980 (72) Авторы изобретения

В. М. Куриненко и Н. В. Калачева!

Казанский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. В. И. Ульянова-Ленина,j71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ

ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения ферментов, модифициро ванных как растворимыми (мономерными или включенными в состав полиме= ров).,так и нерастворимыми солями диазония, в частности для получения ферментов, связанных с растворимыми носителями и иммобилиэованных при помощи реакции аэосочетания. Иммобилизованные ферменты могут быть использованы.в качестве катализаторов в химической промышленности в реакторах проточного типа, а ферменты, связанные с растворимыми носителями 15 помимо использования в качестве ка - тализаторов в химической промышленности, могут найти применение как биологически активные вещества и лекарственные препараты. †-- - 20

Кроме того, изобретение может быть использовано для изменения физико-химических свойств ферментов путем их модификации мономерными солями диазония.

Известно множество примеров модификации ферментов ковалентным связыванием с растворимыми и нерастворимыми носителями(матрицами) С этой целью особенно широко используют спо-30 собы ковалентного связывания ферментов с различными носителями при помощи реакций ацилирования {алкилирования), при помощи изоцианатных (изоцианатных) групп, галоидциана, цианурхлорида и его производных или реакции азосочетания;

Указанные способы характеризуются тем, что связывание фермента с носителем осуществляется практически всегда через аминогруппу диаминомонокарбоновых аминокислот. Исключение составляет метод азосочетания, используя который можно осуществить связывание через амино-, сульфгидрильные, циклические и гетероциклические группы аминокислот. Эта особенность реакции азосочетания дает возможность осуществлять связывание ферментов через значительно большее количество точек, по сравнению со способами, в основе которых лежат узко специфические реакции на аминогруппы белков. Многоточечность связывания, как известно, положительно коррелирует со стабильностью связанных ферментов (1)

Недостатком метода азосочетания является его, во многих случаях, низкая эффективность, определяем

767120

S нт

6S количеством связанного с матрицей (носителем) фермента.

Известен также способ Модификации ферментов путем взаимодействия последних с солью диазония на основе п-аминобензилцеллюлозы 2!

Способ осуществляется обработкой ззотнбй кислотой (или раствором

Na N0> в HCL) аминобензилцеллюлоэу превращают в соль диазония, к которой добавляют растворенный в буфере ферме

После перемешивания и удаления из суспенэии путем ее промывания не модифицированного (не связавшегося с солью диазония) фермента определяют выход конечного продукта. Выход мо- дифицированной рибонуклеазы и химо- трипсина составляет 2,3 и 3,4% соответственно.

Недостаток способа — низкий выход целевого продукта.

Цель изобретения — увеличение выхода целевого продукта.

Указанная цель досТигается тем, что в способе получения модифицированных ферментов путем взаимодействия их с солями диазония, в качестве последних используют диазотированные ароматические амины, содержащие электроноакцепторную группу 5 О или их эфиры с дектраном.

В качестве ароматических аминов, содержащих SO â группу, обычно исполь зуют 4 -8-оксиэтилсульфониланизоловый или 4-В-оксиэтилсульфониланилиновйй спирт, или их эфиры с дектраном, или М - аминобензилсульфонилоксиметил декстран.

Для модификации ферментов используют, например 4-8-оксиэтилсульфониланизолдекстран, который обрабатывают раствором МаМО и НС! при О - 2ОС.

К полученной таким образом соли диазония декстрана после доведения рН до

3-4 добавляют фермент в буфере и оставляют на 14-16 ч. Модифицированные ферменты отделяют от немодифицированных любым доступныМ методом (гельфильтрацией, ионным обменом и т. д.) .

Модификация ферментов солями диазо ния на основе 4-8-оксиэтилсульфониланизолового спирта или 4-В-оксиэтилсульфониланилинового спирта или их эфиров с декстраном увеличивает выход модифицированных ферментов по белку в 4,4 раза, по активности в

3-3,5 раза.

Это увеличивает эффективность связывания ферментов с носителями при помощи азосочетания. увеличение выхода связанных ферментов дает воэможйость широко. использовать этот способ вместо методов ковалентного связывания, основанных на узкоспецифических реакциях. При этом с больщим выходом-возможно получение фермейтов, "- связанных c носителем наибольшим количеством точек свяэйвания, т. е. наиболее стабильных и, следовательно, экономически наиболее выгодных.

Пример 1. Получение рибонуклеазы, модифицированной 4-8-оксиэтилсульфониланизолдекстраном. 175 мг

4-В-оксиэтилсульфониланизолдекстрана растворяют в 2 мл 0,5 н НС! охлаждают до 0-2 !С и добавляют 6 мг йайО . Диазотируют 5 мин, подщелачивают 3,5 н йа0Н до рН 4,0 и к диаэотированному декстрану добавляют

10 мг панкреатической рибонуклеазы, растворенной в 1 мл 0,4 M буфера трис-НС! рН 8,5. Смесь оставляют на 14-16 ч. несвязанвый фермент отделяют от продукта реакции при помощи гельфильтрации на сефадексе

О.-75 в системе 0,2 М NaCE

Выход модифицированной рибонуклеазы по белку 88%, по активности 30%.

Зъ В качестве контроля модификацию рибонуклеазы проводят м-аминобензилоксиметилдекстраном, не содер- жащим заместителей. Выход модифицированного фермента по белку 20%, по активности 8-10%.

Пример 2. Получение рибонуклеазы Асt. rimosus модифицированной

4-0-оксиэтилсульфониланизолдекстраном.

В качестве азосоставляющей используют рибонуклеазу Act.rimosus. Условия связывания и соотношения реактивов те же, что и в примере 1. Выход конечного продукта 68%.

В качестве контроля проводят модификацию рибонуклеазы Act.rimosus

З Я1.- аминобензилоксиметилдекстраном, не содержащим заместителей. Выход конечного продукта составляет 28%.

Пример 3. Получение химотрипсина, модифицированного 4-8-окси4Q этилсульфониланизолдекстраном.

105.мг 4-В-оксйэтилсульфониланизолдекстрана растворяют,в 2 мл 0,5 н

НС1, охлаждают до 0-2оС и добавляют

4 мг NaN0, Диазотируют 5 мин, подще4 лачивают 3,5 н NaOH до рН 4,0 и к диазотированному декстрану добавляют 10 мг хймоФрипсина, растворенного в 1 мл 0,4 М буфера трис-НС! рН 8,5. . Смесь оставляют на 14-16 ч. Несвязанный ферМент отделяют от продукта реакции при помощи гельфильтрации на сефадексе G-75 в системе 0,2 М йаС1.

Пример 4. Получение панкреатической рибонуклеазы, модифицированной солью диазония на основе 4-8>> -оксиэтилсульфониланизолового спирта.

4 мл 4-В-оксиэтилсульфониланизолоэрго спирта диазотируют, как указано в примере.1, затем приливают 2 мл

0,2 М трио-НС! буфера рН 8,5, в котс4!О ром растворено 5 мг рибонуклеазы.

В качестве контроля проводят модификацию рибонуклеазы м-аминобензилоксиметиловым спиртом, не содержащим заместителей.

767120

Составитель О. Скородумова редактор M. Недолуженко Техред А.Щепанская Корректор С Щомак

Заказ,6971/10 Тираж 495

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва- Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,4

Выход модифицированной рибонуклеазы, по сравнению с контролем, увеличивается в 3-4 раза.

Пример.5. Получение панкреатической рибонуклеазы, модифицированной солью диазония на основе 4-ф оксиэтилсульфониланилинового эфира декстрана.

175 мг 4- 8 -оксиэтилсульфониланилинового эфира декстрана диазотируют, как указано в примере 1, добавляют 10 мг рибонуклеазы, растворенной в 1 мл 0,4 М трис-НС1 буфера рН

8,5. Смесь оставляют на ночь. Несвязанный фермент отделяют от продуктов .реакции гельфильтрацией на сефадексе -75 в системе 0,2 М йаС1 35

Выход модифицированного фермента по белку 80%, по активности 27%.

Пример б. Получение панкреатической рибонуклеазы, модифицированной солью диазония на основе 4- 8 - 2О оксиэтилсульфониланилинового спирта.

4 мг 4-8 -оксиэтилсуяьфонилаиилинового спирта диазотируют, как описано в примере 1, приливают 2 мл 0,2 М трис-НС1 буфера рН 8,5, в котором растворено 5 мг рибонуклеазы.

В качестве контроля проводят модификацию риббнуклеазы, м-аминобензилоксиметиловым спиртом.

Выход модифицированной рибонуклеазы по сравнению с контролем увеличи- ЗО вается в 3-4 раза.

Пример 7. Модификация панкреатической PHK-азы м-аминобензилсульфонилоксиметилдекстраном. В качестве азосоставляющей используют 35 панкреатическую PHK-азу, в качестве дыазосоставляющей-м-аминобензилсульфонилоксиметилдекстран. Условия модификации и соотношения реактивов те же, что и в примере 1..Выход конечного продукта по белку 80%, по активности 30%.

В качестве контроля, модификацию

РНК-азы проводят м-аминобензилоксиметилдекстраном, не содержащим группу S О Выход модифицированного фермента по белку 20%, по активности

8-10%.

Формула изобретения

1. Способ получения модифицированных ферментов, включающий взаимодействие ферментов с солями диазония, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, в качестве солей диазония применяют диазотированные ароматические амины, содержащие электроноакцепторную группу 50 или их эфиры с декстраном.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве ароматических аминов, содержащих SO< группу, используют 4-В-оксиэтилсульфониланизоловый или 4-8-окснэтил- сульфониланилиновый спирт, или их эфиры с декстраиом, или м-аминобензилсульфонилоксиметилдекстран.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Иммобилизованные ферменты.

Сборник Под ред. Березина И. В.

Антонова В. К., Мартинека К. МГУ, 1975, т. 1.

2.Ritz M.À. Summaria l .А.

Synthesis of Ь1о1оса11у active

cellulose .derivatives of enzymes.

-"Nature", 1961 v. 189, Ь. 576. (прототип).

Способ получения модифицированных ферментов Способ получения модифицированных ферментов Способ получения модифицированных ферментов 

 

Похожие патенты:
Наверх