Способ культивирования вирусов
т:.Нтнт - .ОпиСАН
Союз Советских
Социалистических
Республик
kj ф»
D // г
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) ЗаЯвлено 19. 0 2. 7 9 (21) 2 7 2 7 58 3/2 8-13 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет—
Опубликовано <507.81. бюллетень № 26
Дата опубликования описания 1507.81 (51)Щ, Кд.з
С 12 N 7/00//
С 12 и 7/00
С 12 R 1/91 осударствеииый комитет
СССР ао делам изобретеиий и открытий (53) УДК 576. 8. 093. .35(088.8) (72) Авторы изобретения
Л.Л.Миронова, В.П.Грачев, Н.В.Кузнецова и В.Д.Попова
Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов
ANH СССР (71) За яв ит ель (54 ) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ
Изобретение относится к вирусоло гии.
Известен способ культивирования вирусов Путем размножения на линии перевиваемых клеток почки обезьяны
Г13.Недостатком известного спосбба является отсутсвие стандартных свойств отдельных клеток, поддержива- 1р емых в разных лабораториях мира, а также контаминация посторонними агентами. Кроме того, в нем используется дифицитная эмбриональная сыворотка.
Цель изобретения — упростить способ. .Эта цель достигается тем, что вирусы размножают на линии перевиваемых клеток почки взрослой зеленой мартышки 4647. 20
Полученная линия клеток почек взрослой зеленой мартышки 4647 имеет следующие морфологические и биологические свойства.
Культура представлена округлыми эпителиоподобными клетками, цитоплазыа не вакуолизирована, ядро срдержит мелкозернистый гетерохроматии и 12 ядрышка.
Клетки линии 4647 образуют монослой на вторые сутки после субкультивирования, причем монослой удается получать даже при внесений в 1,5-литровую матрасную колбу 4 10о клеток, Время удвоения популяции составляет
24 ч. Коэффициент развивки достигает величин 1:2, 1:3. для пассирова« ния клеток используют смесь основной среды Игла с 0,5%-ным гидролизатом лактальбумина и 5-10% сыворотки крупного рогатого скота. Клетки линии 4647 сохраняются в жидком азоте более двух лет без снижения пролиферативной активности, способны длительное время оставаться на стекле без субкультивирования и смены среды, а также выдерживать в течение
21 дня агаровое покрытие с аминопептидом и бикарбонатом натрия.
Клетки линии 4647 чувствительньФ к различным вирусам: вакцинному штамму вируса чумы плотоядных, вакцинным штаммам вируса полиомиелита, пенящим вирусам, а также к цитомегаловирусу обезьян.
Пример 1. Способ культивирования вируса чумы плотоядных ", В 1,5-литровую матрасную колбу с перевиваемыми клетками почек взрослой
770195, зеленой мартышки 4647 на уровне 47 .пассажа вводят 0,25%-ный раствор трипсина, подогретый до 37оС. Через
30 с трипсин удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при 37оС на 3 мин. Затем оставшиеся клетки ресуспендируют в среде роста - смесь
0,5Ъ-ного гидролизата лактальбумина; на растворе Хенкса со средой Игла в равных количествах и 10Ъ сыворотки крупного рогатого скота.Взвесь разли-вают на две матрасные колбы. Эти культуры на уровне 48 пассажа инкубируют при 37 С в течение 2 суток до момента формирования сплошного слоя.
При заражении вирусом среду сливают из культуральных сосудов, клетки однократно промывают раствором Эрла и в каждую матрасную колбу вводят по 10 мл жидкости, содержащей 3,39
БОЕ/мл вируса. Для адсорбции вируса культуры выдерживают при 34 С в течении 1 ч при постоянном покачивании, после чего добавляют поддерживающую среду — смесь 0,5Ъ-ного гидролиэата локтальбутина на растворе
Эрла со средой Игла в равных количествах и 5% аминопептида. Инфицированные культуры инкубируют при 34оС.
На пятые сутки поддерживающую среду удаляют и в сосуды наливают новые порции среды того же состава. Сбор вируса проводят на 8 день после заражения и определяют его титр по методу образования бляшек. Титр равен 5,3 1g БОЕ/мл.
При культивировании вируса q,первичной культуре клеток почек обезьян титр вируса достигает 4,0 1g BOE/ìë.
Пример 2. Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм.
Сэбина" 1 типа.
Клетки перевиваемой линии 4647 получают и готовят к заражению по описанному в примере 1 способу.
При заражении вирусом полиомиелита, штамм"Сэбина" 1 типа, среду иэ культуральных сосудов сливают, клетки промывают раствором Эрла и вводят вирусодержащую жидкость иэ расчета 3 BOE на клетку. Затем добавляют поддерживающую среду, в качестве которой используют смесь 0,5%-ного гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса со средой Игла в равных количествах.
Инфицированные культуры инкубируют при 34с С. Сбор вируса производят на четвертый день после заражения и определяют его титр по методу образования бляшек. Титр составляет
7,5 1g BOE/ìë.
При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезьян получаются аналогичные результаты.
Пример 3. Способ культивирования пенящего вируса обезьян.
Клетки линии 4647 на уровне 45 пассажа определяют от стекла по методу, описанному в примере 1, и эксплантируют в литровую роллерную бутыль в количестве 60х10 клеток. Культуру инкубируют при 37 С во вращающемся состоянии со скоростью 18 об/ч в течение 24 ч до момента формирования монослоя. При заражении вирусом: среду иэ культуральных сосудов слива-. ют, клетки промывают физиологическим раствором и вводят вирус из расчета
10 ТЦД /мл в объеме 30 мл поддерЬ живающей среды. Вращательным движением вируссодержащую жидкость равномерно распределяют по монослою.Адсорбцию вируса проводят при 37оС в течение 1 ч при постоянном вращении
Затем вирусодержащую жидкость удаляют, а в сосуд вводят 100 мл поддерживающей среды с 1% сыворотки телят.
Культуральные сосуды помещают в барабан и вращают с той же скоростью при 37 С в течение 4 дней. После этого проводят сбор вируса с последующим титрованием по развитию цитопатического эффекта. Титр вируса составляет 10 ТЦП /мл.
Параллельно этйм вирусам.заражают культуру клеток почек обезьян в матрасной колбе, находящейся в стационарном положении. В ней вирус размножается до титра 10 ТЦД /мл.
Для получения антигена к пенящему вирусу клеточный пласт снимают замораживанием в смеси спирта с сухим:льдом. Разрушенные клетки осаждают центрифугированием в течение
15 MHH при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость используют в качестве антигена и сохраняют при температуре -10оС. "Нормальный" антиген из незараженных клеток 4647 получают в аналогичных условиях.
Перед использованием в РСК антигены предварительно проверяют на антикомплементарную специфичность.и антигенную активность.
Предлагаемый способ позволяет расширить виды клеточных субстратов, используемых для культивирования вирусов. Применение перевиваемой линии клеток почек взрослой зеленой мартышки 4647 приводит к уменьшению экономических затрат для культивирования вирусов в связи с тем, что может заменить дорогостоящие первичные клетки почек обезьян. Кроме того клетки линии 4647 обладают стандартными биологическими и морфологическими свойствами, не содержат мико-. плазм, имеют высокую пролиферативную активность, легко культивируются на отечественных средах и сыворотках, не теряют своих свойств при хранении в жидком азоте и имеются в запасе.
Использование для культивирования вирусов клеток линии .4647 расширит
770195
Формула изобретения
Составитель С.йаяютина
Редактор М.Кузнецова Техред С. Мигунова Корректор В.Бутяга
Заказ 5757/38 Тираж 528 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035,Москва,М(-35,Раушская наб.,д. 4/5
Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 возможности успешной диагностики вирусных инфекций, позволит получать в значительных количествах антигены пенящего вируса и цитомегаловируса обезьян, приготавливать вакцины для ветеринарной практики.
Способ культивирования вирусов путем размножения на линии перевиваемых клеток почки обезьян, о т л и— ч а ю шийся тем, что с целью упрощения способа, вирусы размножают на линии перевиваемых клеток почки взрослой зеленой мартышки 4647.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Hopps H.Е.at.al. Biological
characteristics of a serlal1i cultivated kidney cells derived from the
african green monkey, Cercoplthecus
aethiops. Fediration Proceedings, 1962, 21,454.
