Синтетический аналог природного пептида тафцина, обладающий фагоцитозстимулирующей активностью

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕЙИЯ в(у с.ила„(: дщ щу

Союз Сьвепких

Соцнаан4тннеамих

Республик о>784218

К АВТОРСКОМУ СВИДИВЛЬСТВУ (6т) Дополнительное к авт. свмд-ву (22) Заявлень 670579 (Л) 2775078/23-04 51 „ „э с присоединением заявки М.

С 07 С 103/52

А 61 К 37/02

Государственный комитет.

СССР ио йелам изобретений. и открытий

Опубликовано 070981. Бюллетень Мо 33 (23) Приоритет (ЗЗ) УДК 547 ° 964. .4(088.8) Дата опублмкьваиня описания 07.0931 (72) Авторы . изобретения

Г.И. Чипенс, Н.И.Веретенникова и З.A. Атаре

Ордена Tpy oaaro Красного Знамени институт органического синтеза AH Латвийской ССР

/ (71) Заявитель (54) СИНТЕТИЧЕСКИЙ АНАЛОГ ПРЙРОДНОГО ПЕПТИДА ТАФЦИНА

ОБЛАДАНИИ ФАГОЦИТОЗ-СТИИУЛИРУКИЦЕЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к области Организм, создание аналога с равной синтетических пептидов, а именйо к тафцину биологической активностью,но новому аналогу природного пептйда . более простого и экономичного, чем тафцина Формулы . з тафцин.

Это достигается описываемым синте6сз-Оп-Plî-A g см сООН Щ . тическим аналогом природного пептида тафцина формулы обладающему способностью стимулировать фагоцитоз. Данный аналог тафци- " ъ на может найти применение в медицк- () обладающим фагоцитоэ-стимулируни ей не, так как ряд эаболеванйй (серпо-, активностью. данный аналог (G)ó

I видная анемия, миелофиброз и другие) C.)п ) -тафцин является, подобно. самосвязан с понижением фагоцитарной ак-, му тафцину, фрагментом домена С„ тятивности лейкоцитов. - .. . - .желой цепи иммуноглобулина человека

Возможно применение тафцина вмес-, 1 5 класса IgG с аминокислотной последото ) -глобулина при лечении ийфек- .вательностью 341-344 f5(. ционных заболеваний после травмати- .... При определении фагоцитарной акческих поражений селезенки, сопровож- . тивностк сегментоядерных нейтрофилов дающихся резким понижением количест-. кройи- крысй по методике В.С. Гостева ва вырабатываемого в организме тафци- 30.. и др. (6) найдено, что представляемое на )1), (2)и (31, . : . соединение активирует фагоцитоз в той

В настоящее время известны много- же степени, что и сам тафцин (табл.1 численные синтетические аналоги таф- . и 2). цина, .образованные модификацией одно- : Согласно этой .методике для опытов го или двух аминокислотных остатков 25 берут кровь крысы, разведенную 2%-ным молекулы (1)и 4). Эти аналоги в оо- . лимоннокислым натрием в отношении 1:1

НоВНоМ обладают более низкой актив- : и растворы изучаемых соединений. В ностью по сравнению с тафцином. . :. . контрольных опытах используют иэотоцель изобретения - расширение ар- ::.иический раствор хлорида натрия. доаенала средств воздействия на:живой. Зф..бав3ьяют суточную культуру коагулаэо784218 позитивного патогенного штамма

Staphylococcuc aureus в концентрации

1 млрд в 1 мл, Смесь инкубируют в теро мостате при 37 С в течение 30 мин.За-, тем пЬиготовляют мазки, фиксируют метанолом по Романовскому-Гимэа. Подсчитывают 100 сегментоядерных нейтрофилов, определяют из них число поглотивших бактерий (Ъ антивных фагоцитов) и среднее количество бактерий в одном сегментоядерном нейтрофи- g ле фагоцитарное число . Фагоцитарные показатели приведены в . табл. 1.

Преимуществом описываемого соеди- .. .нения является применение более дешевых и доступных аминокислот по срав, нейию с тафцином (например; замена

; треонина на более чем в 50 раз деше вый глиций) . Процесс синтеза /Gay+, 4fn2 )-тафцина менее трудоемок, так как не требует введения дополни-. 2О тельных защитных группировок для гидроксилъной функции требнина, гуаниди . новой функции аргинина и т.д. что упрощает и удешевляет возможный его промышленный синтез. 25

О) 2) (r) (6) (6) (7) (4) z

:1

fG1y1, G tn 1-тафцин синтезируют известным методом 13 и 4) ступенча,тым йарациванием пептидной цепи с

С-конца по приведенной схеме. Гуанидиновую группировку аргинина защищают .убразоваЫием внутренней соли,, чем достигают и защиты его карбоксильной функции. Аминокислоты присоединяют. в виде-бензилоксикарбоннл- или трет-бутилоксйкарбонилпроизводнйх акти- . вированных эфиров. Снятие защит на стадиях дипептида и трипептида осуществляют HBr/ëeä СН СООН и

НСР/ледСНэСООН соответственно. Очистку 4р продукта проводят на стадии защищенного тетрапептида хроматографированием на силикагеле. После снятия бензилоксикарбонильной группы гидрированием над палладием получают чистый продукт. для синтеза, нового соединения (1-глицин, 2-глутамин)-тафцина ис" пользуют аминокислоты и их производные фирмы "Реанал", Венгрия. Все аминокислоты, кроме глицина, ). -конфи-гурации. Температуры плавления, определяемые в открытых капиллярах, приведены без поправок. Гомогенность полученных соединений проверяют на .пластйнках "Еаьсвап". Приведены хроматографические подвижности Rg -в следующих системах: A — бензол— этилацетат - уксусная кислота (30г10.

:0,5); Б — н.бутанол — этанол " во- Ц) да - уксусная кислота (80."10:30:5);

 — н.бутанол — пиридин — вода — уксусная кислота (30:20:24:6); Г— н.бутанол — вода — уксусная кислота (4:1:1), а также электрофоретичесмая подвижность по отношению к гистидину

Схема синтеза (1-глицин, 2-глутамин! -тафцина (Ен(5 ) на бумаге ГМ-15 в

1н ° (рН 2 4) и 5н (рН 1 4) уксусной кислоте. Углы вращения определяли на поляриметре Реrkiп Е1mer 141. Для всех соединений данные элементного анализа удовлетворйтельно совпадают с вычисленным содержанием С, М, Н.

Строение пептида подтверждают аминокйслотным анализом, который выполняют на анализаторе Biocak -200 после гидролиэа пептида в запаянной ампуле при 110 С в течение 24 ч.

Пример синтеза. Бензилоксикарбонил-пропил-аргинин (1).

К 4,00 r (11 ммоль) р -нитрофенилового эфира бензилоксикарбонил-пролииа rr 70 мл диоксана при перемешивании добавляют 1,57 r (9 ммоль) аргинина в 40 мл воды. Образовавшийся раствор перемешивают 2 ч, затем упаривают в вакууме (30 С) досуха и растворяют остаток в 15 мл диметилформамида. Раствор перемешивают еще 24 ч, затем прибавляют 100 мл этилацетата и выдерживают б ч в холодильнике.Образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом, эфиром. После перекристаллизации из абсолютного этанола и эфира выход чистого продукта 3,47 г (95 ), т.пл. 137-140 С, td 3 в -46 б (с1, HzO); Ry = 0,00

iA) 0,53 (Б), 0,66 (В), 0,65 (Г), Е„„0,56 (рН 2,4) . трет-БутнЛоксик арбонил- глут амил-пролил-аргинин (3).

3,35 r (8,3 ммоль) бензилоксикарбонил-пролил-аргинина (1/ растворяют в 10 мл ледяной уксусной кислоты и добавляют 10 мл 4н. НВг/лед ° СН СООН.

Через 1 ч упаривают смесь досуха в вакууме (30 с) и образовавшееся масло растирают под эфиром до получения твердогО вещества. Сушат при

1 мм рт.ст. над едким кали. затем растворяют его в 100 мл воды и обрабатывают ионообменной смолой AB 17x8 (15 мл) для получения свободного пролил-аргинина (2). К раствору его в

20 мп воды прибавляют при перемешнвании раствор 4,05 r (11 ммоль) р-нитрофенилового эфира трет-бутилоксикарбонил-глутамина в 45 мл диоксана.

784218

Таблица 1

Фагоцитарные показатели лейкоцитов крови (сегментоядерных нейтрофилов) после воздействия тафцина и (1-глицин, 2-глутамин -тафцина) (1-глицин,2-глутамин)

-тафцин в концентрации

Тафцин в концентрации

Фагоцитарные показатели

Контроль

3 10 3 10

3 ° 10

1

% Активных фагоцитов

76,0 - : 81,2 82,6 66,0 81,3 86,4 86,0 73,0

69,4

Фагоцитарное чи сло

5,4 8,9 7,1 .4,9 7,0 9,0 7,7 6,8

4,6

Через 2 ч растворитель упаривают в вакууме (30 С) и остаток растворяют в 20 мп диметилформамида, раствор пе- ремешивают 48 ч, прибавляют к нему

200 мл этилацетата и выдерживают в холо- дильнике сутки. Выпавший осадок отфильт-. ровывают, промывают этилацетатом, э иром.Выход 3,74 г(79%), аморфн., fat.3- ки. Выпавший осадок отфильтровывают,, промывают этилацетатом, эфиром.Выход 3,74 г (79%); аморфн., (с .) » 0

-64,7 (01, Н20); R У 0,00 .(А), 0,37 (Б), 0,58 (В), 0,59 (r),Ей.цз =

0,54 (рН 2,4).

Пентафторфениловый эфир бензилоксикарбонил-гликина (4).

К раствОРУ 6,30 г (36 ммоль) бензмлоксикарбонил-глицина в 100 мл этилацетата прибавляют прн йеремешивании 6,60 г (Эб ммоль) пентафторфенола в 30 мл этилацетата. Раствор охлаждают до О С и добавляют. 7,40 г Ж (36 ммоль) дициклогексилкарбодиимйда в 30 мл этилацетата. Реакционную смесь выдерживают 1 ч при .0 С, затем

10 ч при комнатной температуре,отфильтровывают дициклогексилкарбамид, 35 упаривают этилацетат до объема 10мг, прибавляют 200 мп гексана и выдерживают в холодильнике 72 ч. Вйпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают гексаном. Выход 10,30 г (92%); Я т.пл. 81-82 С, R g = 0,89 (А), 0,88 (Б), 0;78 (В), 0,89 (Г).

Бензилоксикарбонил-глицил-глута-. мил-пролил-аргинин (6), 3,00 r (5, / ммоль) трет-бутилОк р сикарбонил-глутамил-пролил-аргинина (3) растворяют в 20 мл ледяной уксусной кислоты и добавляют 20 мл (20 ммоль) 1н. НС1/лед. СН СООН,. выдерживают при комнатной температуре

1 ч, упаривают в вакууме (30 С) досу ха, образовавшееся масло растирают под 200 ма эфира до образования твердого вещества, выдерживают его 2 ч при 1 мм рт.ст. над едким кали. Затем растворяют в 100 мл воды и обрабатывают ионообменной смолой АВ

17 х 8 (15 мп) для получения свободного глутамил -пролил-аргинина (5).К раствору трипептида (5) в 6 мл воды добавляют при перемешивании 2,50 г (6,2 ммоль) пентафторфенилового эфира бензилоксикарбонил-глицина (4) н

20 мл диоксана. Выдерживают раствор

2 M при комнатной. температуре, упари;вают растворитель в вакууме (30 С) досуха и остаток растворяют в 8 мл диметилформамида.. Перемешивают образовавшийся раствор 48 ч, добавляют

200 мп этилацетата, образовавшийся осадбк отфильтровывают, промывают

80 мл этилацетата и 10 мл эфира.Выход 2,94 г (87%). Вешество очишают йа силикагеле (колонка 30хбОО) в системе В. Выход чистого продукта 1,71г (51%); f. с 3 > -63 (< 1, 5% СН зСООН); ,йу = 0,00((А), 0,35 (Б), 0, 4 (В),,0,55 (Г), ЕН1з = 0,50 (рН 2,4) . (1-глицин., 2-глутамин) -тафцин (7) .

0,66 г (1,1 ммоль) бензнлоксикарбонил-глицил-глутамил-пролил-аргиннна (6) гидрируют при атмосферном давлении в присутствии палладиевой черни в смеси 20 мл метанола и 0,1 мл уксусйой кислоты в течение 32 ч.

Упаривают, растирают под эфиром. Сушат

;над пятиокисью фосфора при 1 вм рт.ст

Продукт электрофоретически и хромато- графнчески однородный Выход О 45r (86%), т.пл. 182 С (с разл.); (Ы)В-77 (C 0,6, 5 % СН СООН) ; Rg 0,00 (А), 0,08 -(Б), 0,18 (В), 0,15 (Г), КнМ= 0,92 (рй 1,4).

Ф е- .)

7 ""." ". 78421о

Таблица 2 исследования фагоцитариой "актйвности сегментоядерних лейкоцитов крови крысы при воздействии.тафциуа и аналога тафцйна - соедийения

Gly""Gin-Pro-Arg GH3С0ОН-ЗН 0

ly-Gln.-Pro Arg ° CH СООН.ЗН 0 тафцин в концентрации концентрации

Ъ

"10 3 10 3 10 3 10 3 10 . 3 10"

Фагацитарнйе показатели

Ийцекс фагоцитоза

С/А„

1,54 2,29 2,05

2,45

1,91

2,21

Фагоцитарное стимулирование (8 - ин .декс) ..-:

- 100 .Р . P

Рк

29,7 . 39,3

2,23 33,6 32,8

38,2

П р и м е ч а и и е: A — колнчество бактерий в одном сегментоядерном нейтрофиле при воздействии препаратов;

A - количество бактерий в одном сегментоядерном ней к рофиле в контроле1

Р.с - число актйвных фагоцитов при воздействии препарата;

Р„ — число активных фагоцитов в контроле. Формула изобретения

Сйнтетический аналог природного пептида тафцина формулы

l Составитель Г. Желтухина

Редактор л. письман техред м. Рейвес корректор с. шекмар Заказ 6774/66 Тираж 443 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и .открытий

113035, Москва,.Ж-35, РаушскаЯ наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

6Ь-GM-Р1-о-А "Я" CH C0OH: ЭН2О

4 .обладающий .фагоцитоз-стимулирующей активностью.

Источники информации, принятие во внимание при зкспертизе

1..Cunningham 8.А., Rutishauser 0 .Ga1l И.Е., 6осс11еЬ Р.D.,Maxdal H.J

Еde1аап С.М. The cova1епс s trucсиге

of à Human G-Pmmunog tobu f i n. Vi! .

Amino Acid Sequence of Heavó-chai n Cyanogen Bromide Fragments Н, -Н4 . 8i ochemi s t ry, 1970, v . .9, Р 16, р . 3161-3170 .

2. Ede 1 man G .Ì. The cova1åï t

structure о1 à Human 6-.5mmunoglî . bu1 1n . Х1, t -unctiопа 1 3mpii.ca ti on В.iochemi stry, 1970, ч. 9, Р 16, р. 3197-3205.

3 ° Иа)) аг Ч.A. Na 1ecul ar Bas i s of .

Familia1 and Acguired Phagocytosis

Def i с1епсу .1пчо1ving the $etrapept i

de, Thr- -Prî-Arg, Tuft cin. - Ехр1.

Се11.81о1, 1978, ч. 46, Р 1-2, р. 114126 .

Э 4. Konopinska О., Mawrocka E., Siemion J.2., Slopek 5 ., Szymamiec St.

K1onowcka E., Partial seguences of

histones with tuftsin activity.

3nt. Э.Pepti de Protein Res. 1977, ч. 9, 9 1, р. 71-77.

5. Const@ntopou1os А,, Najjar V À.

40 Smith J ..Ч. Tuf tcin deficiency: А пей

syndrome with defect.iче Phagocytosis..Pediас ., 1972, ч. 80, Р 4, р.564572.

6. Гостев В.С., Петряшина .М.Н.,Поповкина C.A., Сааков А.К. Фагоцитоз, комплекты и свертывание крови при недостатке белка в пище, В кн. "Вопросы питания", Труды АМН СССР, т.13, вып. 2, N., 1950, с. 110-116.