Способ получения защитного соматического антигена коринебактерий дифтерии

 

ОПИС

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

С оциаиистичвсних

Республик. (ii) 784878

Й АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 060679 (21) 2767705/28-13 с присоединением заявки ¹(51)М. Кл.

A. 61 К 39/05

Государственный комитет

СССР но делам изобретений н открыти и (23) Приоритет

Опубликовано 07,1280. Бюллетень № 45

Дата опубликованияописания 071280 (53) УДК 616.097 (088. 8) (72) Авторы изобретения

N.Î.Áèðãåð, Н.Г.Фиш и Е,П.Гренкова

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗЩИТНОГО СОМАТИЧЕСКОГО

АНТИГЕНА КОРИНЕВАКТЕРИЙ ДИФТЕРИИ

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционной иммунологии.

Известен способ получения защитного соматического антигена корине- 5 бактерий дифтерии путем выращивания микроорганизмов на питательной среде с последующим высушиванием биомассы, экстракцией из них целевого .продукта и его фракционированием (1), 10

Однако соматический антиген коринебактерий дифтерии, полученный известным спосббом, проявляет малую защитную активность при высокой токсичности. 15

Целью изобретения является повышение иммуногенности и снижение токсичности антигена.

Эта цель достигается тем, что в процессе фракционирования выделяют 20 фракцию с молекулярным весом более

300000 дальтон.

Способ поясняется следующим примером.

Пример, 5940 мг сухой .мик- 25 робной массы коринебактерий дифтерии (штамм 0665 П серовара, гравис, токсигенный) взвешивают в 600 мл

0,5в-ного раствора дезоксихолата натрия на Трис-HCI буфере, М 0,005 рН Щ

8,6. Проводят 18-часовую экстракцию на холоду (+4) при непрерывном встряхивании. Экстракт отделяют от осадка центрифугированием (20 мин при

3000 и 20 мин при 15000) и подвергают диализу. Диализ проводят на холоду в четыре этапа: против фосфатного буфера М 0,01, рН 7,7, против того же буфера М 0,02, рН 7, 2, против дистиллированной воды и против

Трис-HCI (буфера М 0,005, рН 8,6.Экстракт пропускают через бактериальный фильтр со стерилиэующей мембраной МФА

0,2 (размер пор 0,2.мкм).

Затем на приборе для ультрафильтрации экстракт пропускают через четыре мембраны Диафло с последователь но возрастающими размерами пор: ИМ 2ОЕ, XN 50, ХМ 100 и ХМ 300. Разведение и промывку прсмежуточных и окончательных концентраций проводят Трис-HCI буфером рН 8,6. С мембраны ХМ 300 собирают 14,6 мл концентрата (78 мг по сухому весу), т.е. выход этой фракции равен 1,2-1,6Ъ от исходной массы бактерий.

Концентрат с мембраны ХМ 300 представляет собой фракцию дезоксихолатного экстраКта с молекулярным весом более 300000 дальтон. По химическом

784878

Фракции для имм низации, дальто чество тных

) 3ООООО

100000-300000

l2

50000-100000

50000

10

10

Контроль

Формула изобретений

Составитель С.Малютина

Техред М.Петко Корректор М.Демчик

Редактор П.Горькова

Заказ 8700/4 Тираж 673

ВЙИИПИ Государственного комитета СССР, по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Подписное

Филиал ППП Патент, r.Óæãîðîä, ул. Проектная,4 составу фракция является комплексом иэ белка (89, 5Ъ), полисахаридов (8, 3%) ,и н> «леиновых кислот (2, 2%) .

Полученная предлагаемым способом фракция соматических антигенов коринебактерий дифтерии характеризуется высокой степенью иммуногенности при Отсутствии токсичности, что подтверждается следуюцими материалами.

Несколько групп животных (морские свинки) были иммунизированы высокомолекулярной фракцией соматичес— "ких" антигенов коринебактерий дифтерии. Рыли применены разные схемы

Как видно из таблицы, уровень антибактериального иммунитета у мор=ских свинок, иммунизированных высо комолекулярной фракцией соматических З(1 антигенов коринебактерий дифтерии, достаточно высок, чтобы противОстоять заражению животных безусловно смертельной дозой (ДЛ).

Приведенные материалы позволяют считать высокомолекулярную фракцию (м.в.>300000 дальтон) дезоксихолатнбго экстракта коринебактерий дифтерии защитным соматическим антигеном этого микроба, Защитный соматический aHòèген 40 коринебактерий дифтерии в очищенном виде выделен впервые и может быть использован как основа химической вакцины, с помощью которой .устраняется дефицит протнвомикробных антител 45 у больных дифтерией или бактерионосителей. иммунизации и дозы антигена. Для по лучения сравнительных данных параллельно по тем же схемам другие свинки иммуниэированы низкомолекулярными фракциями. Контролем служили неиммунизированные животные. Для определения напряженности антимикробного иммунитета, полученного в ответ на иммунизацию,свинки всех групп были одновременно зараженй живой вирулентной культурой" С .diphtheriae, временно лишенной способности токсинообразования, Результаты опыта приведены я таблице.

-Способ получения защитного соматического антигена коринебактерий дифтерии йутем выращивания .микроорганизмов на питательной среде, с последую-. щим высушиванием биомассы, экстракцией из них целевого продукта и его фракционированием, о т л и ч а ю ш и йс я тем, что, с целью повышения иммуногенности и снижения токсичности антигена, в процессе фракционирования выделяют фракцию с молекулярным весом более 300000 дальтон.

Источники информации„ принятые во внимание при экспертизе

1. Филиппова Л.М. с соавт. Водно солевая экстракция коринебактерий дифтерии с осаждением белковых фракций, Труды МНИИЭМ, 1969, 13, с. 77.