Способ получения @ -аминомасляной кислоты

 

ю 7993!8

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Реслублик (61) Дополнительное к .авт. свид-ву— (22) Заявлено 17 09.79 (21) 2819151/23-04 с присоединением заявки— (23) Приоритет— (43) Опубликовано 30.03.82. Бюллетень №12 (51) М.Кл С 07 С 99/00

С 07 С 101/04

А б1 К 31/195

Государственный комитет ло делам изобретений и открытий (53) УДК 547.466.3.07 (088.8) (45) Дата опубликования описания 30.03.82 (72) Авторы изобретения P. П. Янушевичуте, А.-А. Б. Паулюконис и Б. С. Сухарева (71) Заявители

Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии аЛТЬ и Институт молекулярной биологии АН СССР

1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ у-АМИНОМАСЛЯНОИ

КИСЛОТЫ

Изобрепение относится к усовер шеатствова нному способу получения у-а1минома сляной кислоты, которая шяроко используется как лекарственное средство:и,как химический реактивов.

Известен способ получення у-,ами номасляной иислоты, который заключается 1в том, что Ечглутам инавую кислоту обрабатывают ферментом, притотовлен нььм из л,иофилетзованных клеток Clostridium perfrigens ф1).

Недостатком этого способа я|вляется однократное п|риманенне дороеостоящего zaтализатора.

На иболее близким по технической сущноспи и доспигаемому полож ителыному эффекту является способ, который заключается в том, что L-тлутами новую еоислоту подвергают дека р боиоилированию суспензией бактериальных клеток Escherichia со11, заключенный в диализный мешочек, который помещают в;раствор глутаминовой иислоп ы 12).

Однако этот способ может быть испольэовали только,в неболыыих лабораторных реакторах пер иодичвского действия. При болыших масштабах производства арнменение ферментного катализатора в виде диализного мешка, содержащего взвесь

:клеток, неэффективно, пак как елри этом оильно снижается удельная площадь но- ЗО верхности (на единицу количества катал изато ра), через которую происходит диффузия субстрата,и продукта. Другим недостатком способа является отсутствие данHbIx, показывающих возможность длительного и спользования катализатора. Пражпичесии такая возможность исключается, вследспвне известной нестабильностн. ферментов в нативном состоянии. В целом указанный способ непригоден для применения в промышленности.

Целью изобретения является:интенсификация тгропеоса пол1учетеия у-а ми номасляной кислоты и увеличение стабильности катализируютцего реаицию фермента.

Эта цель достигается при реализации способа получеяия у-амияомасляной,иислоты, который заключается в том, что L-глута;минную иислоту подвергают энзиматическому декарбоксилированию в етрисутствии иммобилизованной Еглутаматдекарбоксилазы и процесс ведут непрерывпто в проточном перемеаииваемом реакторе.

Првменяют нммобилизованную L-.rëóòaматдекарбокоилазу, связаБную через бром,а цетиль ные остатии .модифицированного путем образования бромацетамидных групп, нерастворимым снло хромным носителем. В качестве неуаство1химого сило4

799318

Константа скорости инактивации, ч!

АКТИВНОСТЬ>

E/÷

Условия иммобилизации

Метод иммобилизации (0,01

По примеру .1

Активация 5%-ным раствором глутаральдегида, реакция с ферментом при рН 6,8, 4 С, 18 ч

Концентрация водорастворимого карбодиимида 1%, рН 6,0, 4 С, 18 ч

Концентрация водорастворимого карбодиимида 1%, рН 6,0, 4 С, 18 ч

Концентрация акриламида 13%, метиленбисакриламида — 1 о

Б ром ацетильный

Глутаральдегидиый

345

0,43

Карбодиимидный (присоединение к аминогруппам носителя)

- Карбодиимидный (присоединение к карбоксильным группам носителя, модифицированного янтарным ангидридом)

Включение в полиакриламидный гель

195

0,19

190

0,12 громного .носителя используюп амоноаропил сил охром.

Непрерывный процесс ведут в проточном перемешиваемом реакторе, в который подают .раствор субстрата (L-клутаминовой кислоты) и одновременно отводят часть реакционной смеси, содержащей продукт.

Скорость протока устанавливают таковой, чтобы среднее в|ремя коята1ктиравания было достаточным для степени конверсии оубстрата около 0,95. Реанп1ию атроводят п ри рН и темпер ату|ре, соответствующих области стабилыности иммобил изованного энзима: рН 3,5 — 6,0, преимущеспвенно 4,0—

4,6, и температура 20 — 60 С, преимущестаенно 35.— 50 С, Продукт — у-,аъвиномасляную кислоту — выделяют известными,мепода.м и.

П р и м:е р 1. Пполучение иммобилизованной L-глутаматдекар боисила зы. Иммобилизованную L-глутаматдека1рбоксила зу получают,ковалентным .присоединением фермента к носителю, оодержащему брамацетильные группы. Исходный носитель —амннопролилсилохром СХ-2 5 с размером грабанул 0,3i15 — 0,400,мм. Для введения бромацетильных групп 5 г носителя суспендируют в 40 мл диоксина, вакуумируют

10 — 15 IMHH (вакуум водоструйного насоса), прибавляют 0,45 r бром уксусной кислоты и эквивалентное количество — 0,6 г

Х„Х -дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают на качалке при комнатной темпер атуре,в течение 3 ч. З,атем ыоситель промывают диоксаном, водой и 0,05 М фосфатным буферным раствором, рН 7,2. Для иммобилизации используют и репарат /.-глутамагдекарбокоилазы из

Escherichia coli щт 600, с активностью

33 Е/мг белка (Е-,м,кМ. мин — ). В 50 мл

:раствора L-глутаматдекарбаксилазы (концентраци я 2 мг/мл) в упомянутом буферном растворе суспендируют 5 т активированно го бромацетильными остатками носителя и смесь перемешивают на,качалке

20 ч яр и 4 С. Затем,носитель со авяза нным ферментом промывают 0,05 М фосфатным буфером,,рН 6,0, 1:М .раствором

NaCl m снова тем же:фосфапным буфером.

Активность иммобил изован наго пpBIIapa10 та — 396 Е/г, выход по активности 60%.

Иммобилизаван ный препарат хранят IB холодильнике (4 С) в виде суспензии . в фосфатном буф ере, рН 6,0, содержащем

0,026 иг/мл пи ридоксалыфосфата.

Пол ученный указанным методом преларат иимобилизован ной L-клутаматдека рбоксилазы по стабильности в проточном режиме существенно превосходит пре20 параты, полученные другими методами иммобилизации. Для определения стабильности используют тест стабильности в .колонке при следующих условиях:

0,025 М раствор L- глутами н авой,кислоты, рН 4,6, содержащий О,i013 мг/мл п иридоксальфосфата, прокачивают,микронасосо.м через термостатируем ую цри 55 С .колонку со скоростью 50 .мл/ч. B,о предел енные ннтервалы времени извлекают образец HMMQбилизова|нного препарата и:измеряют остаточную активность методом рН-стата. Критер|ием стабильности является,KGIHcTaBTa пе р вого порядка скорости инактива ции фермента при глуби не,превращения около

50%. Результаты определенная начальной активности и стабильности в проточном режиме препаратов, полученных различными методами, а именно,,иммобылизованной Lглутаматдекарбоксилазы, приведены в таб40 лице. Исходный;носитель — аминопропилсилохром СХ-2,5.

799318

Alp и м ер 2. Процесс получения у-аминомасляной кислоты.

Реакцию проводят в термостатируемо м, перемешиваемом .механической мешалкой ,ми ниреактаре. Реактюр соединен с установкой рН-стата, пюэволяющей поддерияювать постоянный рН путем доба1вления 0,2 н соляной кислоты автоматической бюреткой.

Одновременно самолишупиим потенциометром за писывают скорость подачи типранта, соответствующую GKolpGCTb реаиции декарбоксилирования. Это позволяет определять скорость реакции |в любое время и оценить степень, конверсии. Во время реакции через реактор пропускают небольшой ток азота для удаления выделяющейся двуокиси углерода. Минир еактор снабжен двумя соединенными с микронасосом трубками.

Через юлиу из и|их подают, раствор субстрата, через другую трубку, обеспеченную фильтровальеой перегородкой, отводят часть р еа.кциониой смеси, содержащей у-а,м.и номасляную кислоту.

Скорости подачи субстрата и отвода продукта регулируют таки м образом, чтобы объем реакционной омеси оставался постоянным,и время контажтир ования было достаточно для практически полного завершения!реакциями.

В реактор помещают 25 мл 0,05 М paicтвора L-глутаыиновой,кислоты, содержащего пир идоксалыфосфат концентрацией

0,013 мг/мл и 50 мг .иммюбилизюванной Lглут ам атдекарбоксилазы. Поддержявают температуру реакционной смеои:37 С и постоянный рН 4,6. В;начале прощеоса осуществляют декарбоксилировавие содержащегося в реакторе исходного раствора L-глутаминовой .кислоты. Далее в;реактор подают раствор субстрата ico ско|растью 12 ил/ч.

По данным титрования степень аревраще.ния L-глутамииовой кислоты составляет более 0,9. Параллельно степень превращения контролируют тониослойной хроматографией на лластнниа х «Силуфол» в системе этанол — вода (7: 3). Значения RI глутаминовой кислоты 0,66; Р-амииомаслянюй кислоты — 0,37. Реактор работает бесп1рерывно 19 ч без уменьшения скорости реак ции деыарбокоилирования.. За это время через реактор пропущено 230 мл,раствора субстрата. Для выделения р-аминомасляной кислоты раствора конценврируют упа,ри ванием в вакууме:и продукт осаждают этанолом. Получают 1,0 r у-аминомасляной кислогы, выход 85%. Продукт хроматографическн чистый, т. пл. 199 — 2О1 С, что соответствует литературным данным (203 С).

Преимуществом предлагаемого способа

10 является то, что он позвюляет интенсифицировать процесс и увеличить стабильность катализатора — L - глутаматдекарбоксилазы.

15 Формула изобретения

1. Способ получения у-,аминомасляной кислоты энзиматическим декарбоесилированием L-глутами новой кислоты с последу2О ющим выделением целевого продукта, отл и ч а ю щ,и и с я тем, что, с целью интенсификации процесса и увеличения стабиль,ности катализирующаго реакцию энзима,,процесс проводят в присутствии иммобилизованной L-глутаматдекарбоисилазы н ведут:непрер явно в проточном перемешивае:мо,м реакторе.

2. Способ по п,,1, отлич.ающийся тем, что .используют иммобилнвованную

L-глутаматдекарбаксилазу, аьязанную брома|цетильнььми остатками ют бромуксусной кислоты с нерастворимым силохромиым носителем.

3. Спосеб по пп. 1 н 2, отличаюшийся тем,:что в иачеств е нерастворимого силюхромного носителя используют аминопропилсилохром.

Источники инфор.мации, п,р инятые во

40 вннмаиие п|рн экспертизе:

1. М. N. Camien, L. Е. McClure, А, 1 ерр, М. S. Dunn, «The:preparation of y-laminobutyric acid by enzymic decarboxylation of

45 L-glutamic acid», Arch. Biechem. Biophys, 1953, ч. 43, р. 378 — 80.

2. Е. М. Губарев, Ю. В. Галаев, Ба ктериальный способ получения у-аминомаслянюй::кислоты. Биохимия, 1960, т. 25, вып. 2, 50 с. 262 — 263 (прототип).