Способ получения лимфоцитарныхсуспензий из лимфоузлов крупногорогатого ckota

 

О П И С Д Н И Е» 8108!4

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 18.06.79 (21) 2779296/30-15 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) M. K.

С 12 N 7/00

G 01 N 33/54

Государственный комитет

СССР по делам изобретений н открытий (43) Опубликовано 07.03.81. Бюллетень № 9 (53) УДК 612.42:591. .44 (088.8) (45) Дата опубликования описания 07.03,81

А. P Слепченко, В. П. Шишков и Б. 3. Иткс (72) Авторы изобретения

Московская ордена Трудового Красного Знамени ветеринарная академия имени К. И. Скрябина (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМФОЦИТАРНЫХ

СУСПЕНЗИй ИЗ ЛИМФОУЗЛОВ КРУПНОГО

РОГАТОГО СКОТА

Изобретение относится к биологии, а именно -к разделу генетики — иммуногенетике (генетический полиморфизм по форменным элементам крови). Оно может быть использовано при получении моноспецифических сывороток — реагснтов, необходимых для идентификации антигенов гистосовместимости, т. е. трансплантационных антигенов крупного рогатого скота (система В01 — А, bovine legkocgte antigenes).

Известны методы абсорбции антилейкоцитарных сывороток сельскохозяйственных животных (крупного рогатого скота, свиней) суспензией лейкоцитов, выделенной из цитратной крови животных (1).

Из описанных в литературе способов получения суспензий лимфоцитов, используемых для изготовления моноспецифических иммунных антилейкоцитарных сывороток крупного рогатого скота, наиболее близким к изобретению является способ 12), который проходит по следующей схеме.

Кровь берут с 0,1 М этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) при рН 7,0, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 20 мин, затем добавляют 6 ч дистиллированной воды на 1 ч. центрифугата для лизиса эритроцитов. Суспензию белых клеток крови дважды отмывают 0,15 М раствором

2 при 200 g в течение 10 мин. Из 1000 мл крови получают около 3 мл плотной суспензии лейкоцитов. Для однократной аосорбции 20 мл иммунной антисыворотки

6 используют 2000 мл крови, а для трехкратной абсорбции требуется около 10000 мл крови.

Указанный способ абсорбции связан с взятием большого количества крови у жи)0 вотных (2000 мл — для однократной абсорбции, 10000 мл — для трехкратной абсорбции 20 мл антисыворотки), что отрицательно сказывается на состоянии животных-доноров. Кроме того, при использовании дистиллированной воды для лизиса эритроцитов в суспензии лейкоцитов оказывается большое количество мертвых клеток (20 — 30%), что делает невозможным проводить целенаправленную a6cop6 р цию сырых сывороток позитивными лейкоцитами, так, как реакция микроцитотоксического теста, необходимая для подбора абсорбентов перед проведением абсорбции, основана на использовании живых клеток (количество мертвых клеток не должно превышать 5 — 10%).

Цель изобретения — повышение жизнеспособности клеток и предотвращение их

30 склеивания.

810814

С оста в и тель А. М акаро в

Техред А. Камышникова

Редактор Л. Волкова

Корректор О. Тюрина

Заказ 2146

Изд. _#_o 234 Тираж 530

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1!3035, Москва, Ж-35, Раушская иаб., д. 4/5

Подписное

Загорская типография Упрполиграфиздата Мособлисполкома

Для достижения указанной цели после начесывания суспензию клеток наслаивают ех tempore по градиенту плотности фиколла и центрифугируют 30 — 40 мин, а в качестве буферного раствора используют смесь следующего состава при pII 7,2—

7,4:

0,0001 — 0,0002 н. р а створ Mg С12 О, 1 — 0,2 м л

0,1 — 0,2 н. раствор:NaC1 до .1 л.

Пример. При центрифугировании суспензии лимфоцитов, полученной из брыжеечных лимфоузлов, при 400 q (1800 об/мин) используют буфер следугощего состава: 0,85 /о-ный раствор ХаС1 при рН 7,2, обогащенный Mg++ (из расчета по 0,2 мл 5% МдС!г на 1000 мл 085о/о-ного раствора,NBC1) .

Суспензию лимфоцитов центрифу ируют при 1800 об/мин в буфере следующего состава:

0,1 мл 4%-ного хлористого магния на

1000 мл 0,85 /о-ного раствора NaCI.

0,1 мл 5/о-ного хлористого магния на

1000 мл 0,85%-ного раствора NaCI.

0,1 мл 6%-ного хлористого магния на

1000 мл 0,85 /о-ного раствора NaCI.

0,2 мл 4о/о-ного хлористого магния на

1000 мл 0,85 /о-ного раствора NaCl.

0,2 мл 5 /о-ного хлористого магния а

1000 мл 0,85о/о-ного раствора ИаС1.

0,2 мл 6 -ного хлористого магния на

1000 мл 0,85 -ного раствора NaCI.

При конечных и средних значениях буфера не происходит склеивания лимфоцитов и полученная суспензия лимфоцитов содержит необходимое для абсорбции количество клеток (50 — 70 ° 10 клеток в

1 мл суспензии).

Время, затраченное на получение брыжеечных лимфоузлов при убое крупного рогатого скота и на выделение чистых лимфоцитов, доведено до минимума (30—

40 мин). Это дает возможность повысить жизнеспособность лимфоцитов до 90 — 95%.

При этом клетки выделяют из лимфоузлов в следующем порядке: поочередно начесывают лимфоузлы от каждого животного, немедленно наслаивают суспензию клеток на градиент плотности (9% фиколл+33 /о верографин), центрифугируют 30 — 40 мин

4 при 400 g и только после этого приступают к обработке лимфоузлов следующего животного.

Таким образом, во время получения

5 чистых лимфоцитов клетки постоянно находятся в благоприятной среде (в градиенте плотности или в самом лимфоузле), котсрая максимально сохраняет их жизнеспособность.

l0 Жизнеспособность лимфоцитов проверяют после центрифугирования с помощью

1 /о -ного раствора трипановой сини по

Kissmeyer-Nielson. Красят в течение 10—

15 мин и под микроскопом устанавливают

15 жизнеспособность клеток. Полученные предлагаемым способом суспензии лимфоцитов содержат не более 5 — 10 мертвых клеток, что вполне пригодно для дальнейшей работы.

Формула изобретения

Способ получения лимфоцитарных суспензий из лимфоузлов крупного рогатого

25 скота, включающий механическое начесывание клеток в буферный раствор, центрифугирование в градиенте плотности фиколла, отличающийся тем, что, с целью повышения жизнеспособности клеток и

30 предотвращения их склеивания, после начесывания суспензию клеток наслаивают ех tempore по градиенту плотности фиколла и центрифугируют 30 — 40 мин, а в качестве буферного раствора используют

35 смесь следующего состава при рН 7,2 —7,4:

0,0001 — 0,0002 н. раствор МдС12

0,1 — 0,2 мл

Л.

0,1 — 0,2 н. раствор NaC1 до 1

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. М. Vaiman et а! The Я вЂ” А Hisiocom45 patibility system in the SUS SCROFA

SPECIES.

1. Transplantation, 1972, ч. 14, 5.

2. R. 1. Spooner et al, Eridence for

possible major histocompatibility complex

50 (ВI.А) in саШе, 1. j. Immunogenetic, 1978.