Стабилизированная стрептокиназа,обладающая тромболитической активностью

 

Стабилизированная стрептокинаэаобщей формулы-"^^^0..,ан но'НгСcHa->&iH-cii;)U^'CHjOH -сн^рн /^^CHjOHгде - Щ - Стр - нативная стрепто~ киназа, обладающая тромболитической активностью. , .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (191 (11) t

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ;»

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

СИ ОН

Н»С

» — — 0 (;Н2 NH-с д О сн,ан ф, (ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ГО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2806452/23-04 (22) 30.08.79 (46) 30.07.86. Бюл. № 28 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР и Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков и ферментов медицинского назначения (72) Е.И.Чазов, В.Н.Смирнов, В.П.Торчнлин, И.М.Терешин и Б.В. Москвичев (53) 577. 15(088 ° 8) (5D 4 С 12 И 9/70, С 12 N 11/10//

А 61 К (54) СТАБИЛИЗИРОВАННАЯ. СТРЕПТОКИНАЗА, ОБЛЩАКЩАЯ ТРОМБОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВ-.

НОСТЬЮ (57) Стабилизированная стрептокиназа общей формулы где — NH — Стр — нативная стрентокиназа, обладающая тромболитической активностью.

822551

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности, а именно к синтезу биологически-активных химических соединений, проявляющих тромболитическую активность. Описываемые соединения представляют собой полисахаридные производные стрептокиназы.

Стрептокинаэу достаточно широко применяют в медицине в качестве тромболитического препарата при терапии таких заболеваний, как инфаркта миокарда, тромбозы. тромбоэмболии легочных артерий. Препарат вводят внутривенно в течение нескольких дней. Однако терапия стрептокиназой осложЪ няется двумя обстоятельствами.Во-первых, как и все ферментные препараты, стрептокиназа быстро инактивируется в физиологических условиях под действием рН, температуры, эндогенных протеаз и природных ингибиторов и быстро выводится из кровотока, что приводит к необходимости введения больших доз фермента в течение продолжительного времени. Во-вторых, стрептокиназа представляет собой чужеродный белок, который вызывает .сильную1иммунологическую реакцию организма. Кроме того, частое или повторное применение стрептокиназы может вызывать нежелательные реакции вплоть до анафилактического шока даже при первом ее применении.

В настоящее время известно, что во многих случаях связывание ферментов с растворимыми биосовместимыми полимерами позволяет получать препараты, обладающие по сравнению с нативными ферментами значительно повышенной стабильностью по отношению к различным инактивирующим воздействиям, замедленным выведением из организма и пониженной антигенностью. Наиболее удобными и хорошо зарекомендовавшими себя с точки зрения биосовместимости носителями ферментов являются полисахариды, например декстраны.

Известны полисахаридные производные стрептокиназы, в частности иммобилизованная стрептокиназа, представляющая собой стрептокиназу, связанную с активированным бромцианом растворимым декстраном. Эти соединения представляют, преимущественно, теоретический интерес, поскольку способ их получения включает активацию декстрана высокотоксичным соединением — бромцианом.

40

И1С с4рн

САМ

50 5

Биосовместимость такого носителя проблематична, посколЬку содержащиеся в нем активные группы циклических иминокарбонатов отличаются высокой реакционноспособностью и могут вступать в непредсказуемые реакции с другими белками организма.

Цель изобретения состоит в получении нового препарата, обладающего ценными свойствами, обуславливающими его применение в медицине, в расширении ассортимента иммобилиэованных и стабилизированных ферментов медицинского назначения и s получении полисахаридных производных стрептокиназы, обладающих тромболитической активностью, повышенной стабильностью, пониженной антигенностью и увеличенным временем циркуляции в кровотоке с использованием носителя, отвечающего медицинским требованиям, полученного без использования токсичных реагентов и не содержащего после иммобилизации свободных реакционноспособных групп.

Цель изобретения достигается свойствами стабилизированной стрептокиназы, получаемой связыванием стрептокиназы при 8-30 С и рН 6,010,5 с предварительно окисленным водорастворимым декстраном общей формулы (С Н„,Оу.)к, где х — 100-1000, и восстановлением полученного продукта боргидридом натрия.

Схематическое строение целевого продукта может быть представлено виде где NH — Стр — нативная стрептокиназа. Мол.м. полученного продукта

100000 300000, содержание белка

10-207., содержание декстрана 60-80Х.

Полисахаридное производное стрептокиназы обладает тромболитической активностью, повышенной стабильностью, пониженной антигенностью, увеличенным временем циркуляции в организме.

Продукт полностью сохраняет биолбгическую активность, согласно данным испытаний in vivo u in vitro, и обладает целым рядом преимуществ

ll

8225 зировали однократно внутривенно препаратом нативной стрептокиназы в дозе 0,77 мг/белка/кг. Через три недели этим животным вводили модифицированный фермент в трех предполагаемых терапевтических дозах (см.табл.7).

Как видно из представленных данных предварительная иммунизация нативным ферментом не изменяла иммунный ответ к модифицированному ферменту. Титры антител в обеих группах практически не отличаются. Более того, превышение титров антител над титрами антител нормальных животных практически отсутствует. Аналогичные результаты, показывающие, что предварительная иммунизация не изменяет, а главное не усиливает иммунный от.вет к модифицированной форме были получены в опытах на мышах. Важно отметить, что у кроликов или мышей мы не наблюдали минимальных признаков анафилактической реакции.

В экспериментах на морских свинках влияние предшествующей иммунизации оценивали методом активной системной анафилаксии. Установлено, что введение разрешающих доз препарата модифицированной стрептокиназы жи.вотным, получавшим ранее препарат нативной стрептокиназы, не приводило к заметной шоковой реакции.

Установлено, что предварительное введение нативного фермента у экспериментальных животных не усиливает иммунной ответ к модифицированному ферменту.

Отсутствие выраженного гуморального ответа к модифицированному ферменту, полное отсутствие или слабое проявление анафилактогенной H кожносенсибилизирующей активности в испытанных нами дозировках свидетельствуют, что аллергизирующий потенциал препарата не высок.

Антигенные свойства стабилизированной стрептокиназы изучали в опытах по истощению плазмы. Для этого в пробирки вносили- такое количество препарата нативной стрептокиназы, которое полностью связывает антистрептокиназные антитела и поэтому лизиса искусственнбго тромба не происходит. Далее добавляются различные количества модифицированного фермента и тромбин. Оказалось,что для получения лизиса сгустка необходимо такое же (а не меньшее) количе10

51 12 ство модифицированного препатата, как в пробах, где нативный фермент предварительно не добавлялся. Если же вначале добавляется модифицированный фермент, то для проявления каталитической активности необходимо добавить такое же количество нативного фермента, как в опытах без истощения. Таким образом, полученные результаты показывают, что модифицированный фермент не взаимодействует с антителами человека.

Исследование влияния плазмы крови ,кроликов на активность нативного и модифицированного фермента также не выявило выраженного взаимодействия антител с энзимами. Образцы плазмы в этих опытах получали от животных иммунизированных различными дозами препаратов нативной и модифицированной стрептокиназы. Результаты определений представлены в табл. 8..

Изложенные выше результаты испытаний показывают, что:

1. Лечение экспериментального тромбоза методом однократной внутрйвенноструйной инфузии эффективно при минимальной дозе препарата 50000 ед/кг веса. Лизис тромба начинается в первые полтора часа после инфузии и спустя сутки проходимость кровеносных сосудов оказывается полностью восстановленной.

2. Нормализация изменений системы свертывания крови, вызванных введением иммобилизованной стрептокиназы, 4 наступает у. подопытных животных на вторые-третьи сутки, что свидетельствует о продлении фибринолитической активности препарата в 2-3 раза по сравнению с нативной стрептокиназой.

Пролонгация эффекта фибринолиза у стабилизированной стрептокиназы увеличивается с увеличением дозы препарата.

3. Стабилизированная стрептокиназа обладает малой токсичностью. Внутривенное введение препарата в дозах, превышающих максимальные терапевтические в 50-100 раз хорошо переносятся животными.

4. Аплергизирующий потенциал стабилизированной стрептокиназы не высок, поскольку при испытании на морских свинках анафилактогенная и кожносенсибилизирующая активность практически отсутствовала.

l3 822551

14

5. Антигенная активность модифициро- эффективность тромболитической теванного препарата снижена. В опытах рапии.

Ъ по истощению плазмы модифицированная стрептокиназа не взаимодействовала с Стабилизированная стрептокинаэа антителами человека. может применяться для лечения острых

Создание иммобиличованных препара- тромбоэмболий и тромбозов легочных тов-фибринолитнков, обладающих про- артерий, мозговых сосудов, перилонгированным действием, позволит за- ферических артерий (до того, как менить многодневный внутривенно-ка- развилась гангрена), при тромбофлепельный способ введения препарата lO бите, тромбоэе периферических вен, одноразовым внутривенно-струйным, остром инфаркте миокарда, тромбозе сократить курсовую дозу и тем самым центральной вены или артерии сет ЩТ: снизить число осложнений и повысить ки глаз °

Таблица 1

Назначение опытной

Наименование препарата

Число наблюдений

Число методов исследований каждого живот« ного овторяемость аждого метода сследования группы животных а. Исследование на модели тромба яремной вены кролика

Контроль

Опыт 1

2 -3

1-3

Стрептокиназа нативная,4"6 .

14-15

Стрептокиназа стабилизированная из примеров 1 и 2 10 Опыт ХТ

14-15

2-6 б. Исследования на модели тромба бедренной вены собаки

Контроль

Опыт 1

2-3

Стрептокиназа нативная

1-6

Опыт ХЕ

Стрептокиназа стабилизированная из примеров 1 и 2

1-6 в. Исследование на модели тромба бедренной артерии собаки

Контроль

Опыт 1

2-3

1-3

Стрептокинаэа нативная

1-6

Стрептокинаэа стабилизированная иэ примеров 1 и 2

Опыт II

15.1 -6

3 822551 4 по сравнению с нативной стрептокина- Концентрированный раствор стабилизой. зированной стрептокиназы пропускают

Получаемый целевой продукт пред- через стерильный фильтр "Ииллипор ставляет собой стрептокиназу, свя- .(диаметр пор 0,45 мк) и высушивают занную с окисленным декстраном. Сте- . 5 риофильно. пень окисления декстрана 5-357.. Связывание фермента с окисленным декст- Выход препарата составляет 1500 мг раном идет по механизму образования с удельной фибринолитической активШиффовых оснований между альдегидны- ностью 4300 ед/мг препарата и общей ми группами декстрана и аминогруп- 10 активностью 6500000 ФЕ, что составлами фермента. Реакция связывания . ляет 507, от исходного. протекает в растворе 30-120 мин. Полученный продукт имеет мол.м.

После связывания с ферментом непро- 100000. Представляет собой пористую реагировавшие альдегидные группы но - массу белого цвета, без запаха, без сителя легко переводятся в инертные 15 вкуса. Гигроскопичен, легко раствооксигруппы под действием мягкого рим в воде, в изотоническом 0 9Х восстановителя — боргидрида натрия. растворе натрия хлорида, практически

Целевой продукт выделяют лиофильной не растворим в 957. спирте, эфире и сушкой после восстановления боргидри-" хлороформе.

:дом натрия и после диализа против 20 Пример 2. 1 г декстрана.-поводы в течение 18-40 ч при 4-7 С для лиглюкина растворяют в 20 мл дистилдополнительной очистки препарата. лированной воды и добавляют 613 мг.

Пример 1. 2 r декстрана— периодата калия. Окисление проводят полиглюкина растворяют в 40 мл дис- при температуре 22 1 2 С и постоянтиллированной воды и добавляют 1,226 I 25 ном перемешивании в течение 1 ч. периодата калия. Окисление проводят Полученный раствор окисленного о при температуре 22 + 3 С и постоян- . полиглюкина со степенью окисления ном перемешивании в течение 1 ч. 22 + 27 пропускают через стеклянную

Полученныи раствор окисленного колонку, заполненную .5 r анионита полиглюкина пропускают через хромато-З0 APA в ацетатной форме для полного графическую колонку, заполненную 10 г отделения ДАПГ от анионов НСОО анионита АРА в ацетатной форме, от- 10<, 10э . Ha выходе из колонки отбрасывают объем элюата, равный мерт- брасывают объем элюата, равный мертвому объему колонки — 6 мл, и соби- вому объему колонки — 4 мл, а 20 мл4 рают оставшиеся 40 ыл в мерный ци35 содержащие ДАПГ в концентрации линдрa 50 мг/мл, собирают в мерный цилиндр.

20 мл очищенного полиглюкина сме-.

40 мл .очищенного и окисленного шивают с 5 мл 0,5М содового буфернополиглюкина смешивают с 10 мл 0,5М ro раствора РН 9,35 (до концентрации содового буферного раствора РН 9,25 ДАПГ 40 мг/мл) и добавляют при легком р ц ФЛ 40 мг/мл) и

40 перемешивании 500 мг стрептокиназы добавляют при легком перемешивании фирмьг Берингверк.

1000 мг стрептокиназы фирмы "БерингIf верк Реакционную смесь в объеме 25 мл реакционную смесь в объеме 50 мл . выдерживают при РН 9, 1 при темпеРавыдерживают при рН 9 9 при комнатной 45 туре 20 + 2 С 40 мин, охлаждают на температуре 1 ч, затем ее охлаждают бане со льдом до 4 С и добавляют до 4 С и добавляют мелкими порциями небольшими порциями 224 мг боргидрида

45Р мг боргидрида натрия. Реакция натРиЯ. РеакциЯ восстановлениЯ провосстановления проходит B течение ходи за .30 н.

1 ч при РН 9, 25.

50 Затем раствор стабилизированной стрептокиназы ставят на диализ проРаствор стабилизированной стреп- . тив дистилл истиллированнои воды на 18 ч токиназы разбавляют апирогенной во- при 4-7 С H sarcymaaaroz лиофильйо дой до. 00 мл и заливают в ячейку Выход препарата составляет 1100 мг установки для диафильтрации ТСГ-10 55 с удельной активностью 1700 ед/мг фирмы "Амикон". Собирают диафильтрат препарата и б (1000 мл) и отб о щеи активностью мл и отбрасывают, а раствор 1875000 ФЕ, что составляет ЗОЛ от в ячейке концентрируют до 25 мл. исходного.

822551 6 ба. Для каждой серии анализов крови ю животного брали 10-12 мл крови из неповрежденных вен. Кровопотерю восполняли введением равного колим 5 честна стерильного физиологического раствора; Динамику образования и лизиса тромба наблюдали визуально и мунуально на протяжении первых шести часов опыта, через одни, двое и

10 трое суток. Ангиографию и флюометрию проводили до начала опыта, через одни, двое и трое суток. По завершении эксперимента животных забивали, после чего для гистологического ис15 следования брали кусочки кровеносных сосудов в местах фиксации тромбов.

Изучение тромболитической активности стабилизированной стрептокиназы проводили на моделях тромбов — 20 бедренных артерий и вен собак и яремной вены кролика (см.табл. 1).

Полученный продукт имеет мол.м

100000. Представляет собой порнсту массу белого цвета, без запаха, без вкуса. Гигроскопичен, легко растворим в воде, в изотоническом 0,97-но растворе натрия хлорида, практически не растворим в 957.-нои спирте, эфире и хлороформе.

Полученный продукт ковалентного .связывания стрептокиназы с окисленными декстранами удовлетворяет как клиническим, так и технологическим ,требованиям получения лекарственных препаратов: матрица не содержит токсичных групп, избыточные реакционноспособные альдегидные группы во избежание их связывания с белками, содержащимися в организме, восстановлены до гидроксильных, при реакции не используются высокотоксич ные вещества.

Диальдегиддекстран не оказывает, нежелательного побочного воздействия на организм, поскольку токсичность ферментов иммобилизованных на нем 25 не вышее, а подчас ниже, чем у нативных, а иммуногенность и антигенность ферментов в результате их модификации окисленными декстранами существенно снижается. 30

Биологическая активность полученных препаратов была проверена на экспериментальных животных. Исследование проведено на кроликах-самцах породы "шиншилла", весом 2,2-2,5 кг и на беспородных собаках весом 1235 .13 кг.

Исходя из предполагаемого пролонгированного фибринолитического эффекта действия стабилизированной

40 стрептокиназы, изучаемую дозу препа-. рата — 30000 — 240000 ед/кг веса— растворяли в физиологическом .растворе для кроликов в 20-30 мл, а для собак в 50- 100 мл .и вводили шприцом

45 на протяжении 20 мин внутривенно струйно, а не по инструкции к стрептазе (внутривенно-капельным Методом на протяжении 16-18 ч).

Введение испытуемого (и контрольного) препарата начинали через 1 ч после образования тромба. Препарат вводили кроликам в вену на стороне образования тромба в яремной вене, собаке — в вену задней лапы. ™

Анализ крови проводили перед началом эксперимента, через 2,3 ч

1, 2, 3 суток после образования тромРезультаты, полученные на собаках, подтвердили закономерности тромболитической терапии, установленные на кроликах.

Для испытания тромболитической активности нативной и стабилизированной стрептокиназы препараты вводили методом однократной внутривенно-струй ной инфузии в течение 20 мин. Результаты приведены в табл. 2.

Таким образом, из полученных данных следует, что минимальная терапевтическая доза стабилизированной стрептокиназы составляет 50000ФЕ/кг

t оптимальная — свыше 100000 ФЕ/кг, а тромболитическая активность нативной и стабилизированной стрептокиназы равнозначны.

Изучение изменений свертывающей и фибринолитической систем крови.

Проводили измерение времени рекальцификации плазмы после введения подопытным животным стабилизированной или нативной стрептокиназы (в сек.).

Установлено, что при введении стабилизированной стрептокиназы время рекальцификации плазмы значительно удлинилось.

Кроме того, проводили определение концентрации фибриногена у подопытных животных в мг7. по Г.А.Рутбергу взвешиванием воздушно-сухого сгустка фибрина, образованного при рекальцификации цитратной плазмы.

Установлено, что концентрация фибриногена в плазме крови кроликов

822551 резко снижается в первые часы после введения препаратов стрептокиназы.

Через сутки концентрация фибриногена возвращается к исходной или возрастает по сравнению с ней. У тех животных, у которых тромбы лизировалиеь после введения иммобилизованной стрептокиназы, концентрация фибриногена возрастала через сутки в меньшей степени, чем у животных, у кото- 10 рых тромбы не лизировались. У собак . концентрация фибриногена резко падала через 2 ч после введения испытуемых препаратов и нормализовалась через сутки, после чего нарастала. 15

Наряду с удлинением времени рекальцификации плазмы и снижением концентрации фибриногена через 2-3 ч после введения препаратов наблюдалось также укорочение времени лизиса эугло-20 булиновой фракции плазмы, определяемое по Коваржику.

Результаты приведены в табл.3.

Полученные результаты свидетель25 ствуют об усилении фибринолитической активности крови.

Изменение лизиса эуглобулиновой фракции плазмы у кроликов после вве дения опытного и контрольного образ-

30 . цов стрептокиназы было столь выраженным, что сгусток из эуглобулиновой фракции плазмы лизировался мгновенно. Восстановление тромболитической активности крови до исход-. ного уровня происходило через сутки после введения препарата. До опыта лизис тромба эуглобулинового сгустка ,происходил более, чем за 4 ч. Иногда лизиса не было даже через 24 ч. Однако, в плазме крови, взятой через

2 ч после введения препарата, лизис происходил очень быстро, причем у кроликов наблюдалась четкая закономерность — если лизис сгустка не ускорялся, то лизиса тромба, как прави45 ло, не происходило. Изменение лизиса эуглобулиновой фракции крови у собак не столь значительно, как у кроликов, и нормализуется за одни сутки.

50 Для выявления изменений свертывающей и .фибринолитической систем крови у кроликов в зависимости от введения нативной и стабилизированной стрептокиназы были проведены тромбоэласто . 55 графические исследования (ТЭГ) на тромбоэластографе "Тромб-2". Результаты приведены в табл. 4, Приведенные данные показывают, что у тех кроликов, у которых произошел лизис тромбов после введения стабилизированной стрептокиназы, существенные изменения показателей

ТЭГ наблюдались лишь черед одни сутки (удлинение г, соответствующие невидимой свертываемости и удлинение К,, характеризующее начало образования, сгустка фибрина). Удлинение времени этих двух величин свидетельствует о гипокоагуляции, Уменьшена и амплитуда "та", свидетельствующая об уменьшении вязкости свернувшейся крови. Коагуляционный индекс (c"1) также снижается значительно лишь через сутки (на 707. от исходного).

При введении нативной стрептокиназы наибольшие изменения показателей ТЭГ наблюдались уже через 2 ч после введения препарата. Индекс коагуляции снижался на 75Х и через

2 суток показатели ТЭГ полностью нормализовались. В случае же введения стабилизированной стрептокиназы показатели ТЭГ былирезко изменены до пяти суток после введения препарата, т.е. наблюдалась пролонгация действия иммобилизованной стрептокинаэы по сравнению с нативной. У животных, у которых лизис тромба после введения стабилизированной стрептокиназы не произошел, показатели ТЭГ, измененные через 2 ч пос ле введения препарата, через сутки

1практически нормализовались.

По данным записи на коагулографе

Н-33 обнаружено резкое замедление времени свертывания через 2 ч и

1 сутки после введения стабилизированной стрептокиназы. Через двое суток время свертывания возвращается к норме. В случае введения подопытным животным той же дозы нативной стрептокийазы время свертывания ускоряется до исходного уже к концу первых суток.

В тех опытах, где кроликам была введена большая доза стабилизированной стрептокиназы (свыше 100000 ед/кг веса) почти всеми тестами отмечалась пролонгация действия препарата до трех суток. При этом на тромбоэластограмме определяли резкое удлинение времени свертывания, уменьшение площади ветвей ТЭГ, снижение индекса свертывания. Пролангация действия

9 8225 фибринолизина на протяжении двух-трех суток подтверждалась и данными коагулограммы — удлинение времени рекальцификации плазмы, снижение активности

ФСФ (фибриносвертывающего фактора), толерантности плазмы к гепарину.

При проведении подобных испытаний на собаках тромботест также нормализовался через сутки (изменение показателей T3rэ удлинение r11 и "к11Ъ fo уменьшение амплитуды "та", снижение коагуляционного индекса "с1" на 707. от исходного).

Токсичность стабилизированной строптокиназы в острых опытах изучена на белых мышах и кроликах. В опытах на мышах CWP массой 18-20 г нативную, стабилизированную стрептокиназу и окисленный декстран, являющийся матрицей иммобилизованного пре- 2р парата, вводили внутривенно в виде водных растворов в объеме 0 5 мл.

3а животными наблюдали в течение

7 дней.

Установлено, что однократное вве- 25 дение нативной стрептокиназы в дозах до 1 r/êã и стабилизированной стрептокиназы и модифицированного декстрана в дозах до 2 г/кг не вызывает гибели мышей и не отражается на их 30 поведении и внешнем виде (см.табл.5).

Полученные результаты позволяют утверждать, что оба препарата при однократном внутривенном введении мышам в,дозах, превышаняцих макси-, 35 мальные терапевтические дозы в 50100 раэ,.xopomo переносятся животными и что стабилизированная стрептокиназа не обладает большей токсичностью, чем нативная.

Хорошо переносили стабилизированную стрептокиназу и кролики..Внутривенное введение им препарата в дозах .;.50 и 100 тыс ° ЕД/кг не сопровождаось никакими проявлениями токсичес- 45 кого действия за исключением незначительного увеличения фибринолитической активности крови. После введения модифицированной стрептокиназы в дозе 200 тыс. ЕД/кг имел место несколько более выраженный фибринолиз, однако, и эта доза препарата никак не сказывалась на состоянии животных

Аллергенные свойства стабилизированной стрептокиназы изучали на морских свинках.

Для определения. анафилактогенной активности стабилизированной стреп51

10 токиназы морских свинок иммунизировали однократно дозами 1,0, 0,5, О, 13 и 0,05 и О, 005 мг белка/мг, что в пересчете на активность составляет

31000, 15500, 4200, 1700 и 155 МЕ/кг.

Результаты этих исследований, а также сравнение их с данными по нативной стрептокиназе и другим ферментам, обладающим тромболитической активностью, приведены в табл. 6.

Как показали испытания, стрептокиназа в стабилизированной форме практически не обладает анафилактогенной активностью, особенно при сравнении с такими ферментами, как террилитин и гигролитин.

Кожносенсибилизирующую активность стабилизированной стрептокиназы изучали на морских свинках и кроликах.

1Каждый опыт включал три группы животных по 5-6 штук, которые получали препараты однократно в дозах

31000, 4200 и 1700 МЕ/кг. Кожные реакции учитывали через 3 и 24 ч.

Во всех опытах были получены отрицательные результаты.

Полученные результаты свидетельствуют, что в испытанном диапазоне дозировок модифицированная стрептокиназа практически лишена кожносенсибилизирующей активности, что согла суется с данными системой анафилаксии . (АА) и результатами проведения пассивной кожной анафилаксии (ПКА).

Таким образом, на основании изу-* чения анафилактогенных и кожносенсибилизирующих свойств иммобилизованной стрептокиназы, можно сделать вывод, что фермент обладает незначительным аллергизирующим потенциалом для лабораторных животных.

Моделирование условий применения модифицированной стрептокиназы в сен- сибилизированном организме.

Хорошо известно, что на протяжении жизни человек неоднократно сталкивается в возбудителем стрептококковых инфекций. В результате такого контакта у многих людей наблюдается повышенное содержание антистрептокиназных антител. В связи с этим представлялось необходимьм выяснить влия-. ние предшествующей сенсибилизации к нативному.ферменту на иммунный ответ к модифицированной форме. Опыты проводили на мышах, морских свинках и кроликах. Для создания антистрептокиназного фона животных иммуни16

822551

Контроль

Нет

То же

То же

Вена собаки

Опыт 1

Яремная вена 30000 .кролика.Нет

То же

50000

85000

То же

8:5000

70000

То же

Вена собаки

Артерия собаки 70000 .Опыт 2

Нет

То же

Нет

Нет

Стрептокиназа нативная

Стрептокиназа стабили9ированная иэ примеров 1 и 2

Яремная вена кролика

Артерия собаки

Яремная вена кролика

210000

Та блица 2

Лизис полный

Лизис полный

Лизис полный

Лизис полный

Лизис полный

Ли9ис полный

Ли9ис полный

Ливис поли И

То же

18

Продолжение табл.2

822551

Х

240000

Лизиса нет

Лизис полный

70000

То же

Лизис полный

Таблица 3

Количест- Препарат во жиДо опыта вотных

Через сутки

Через

2 суток

Через

3 суток ерез

-3 ч

4 кролика 4 ч 13 мин

4 ч.

4 кролика Без эффекта 4 ч 4 ч

4 ч

2 собаки

50,55;

35-40

47,65 мин мин

120 мин

60,75 мин

85,60 мин

4 кролика

4 ч 27 мин

4 ч

4ч 4ч

4 ч

84 мин 64 мнн

90 мин

Стабилизированная стрептокиназа из примеров и 2 (тромболизис) Стабилизированная стрептокиназа (тромболиз) Стрептокиназа нативная (эффект тромболиза) 2 кролика Без эффекта

1 собака

Вена собаки 55000

То же 70000

Артерия собаки 55000 Лизиса нет

Время исследования после введения препарата

82255i

;(Ю

»ф» аь о

СЧ

1 О а ° оо

С» w ао

Ф» С» ! o

« Ъ а °

С Ъ а I

СЪ а ь

»Юа

Сса а

СЧ

I о о а

» » !

С Ъ а ь

СЧ

° s !

СO а ь

С Ъ

Ф л а

Саа

«» о о о и

1О с сч а ьюо

1 м а о

С Ъ

Ф о

«ч

° Ф о о в

° s a

° ь

СЧ «СЪ а а о л сч чЪ ф

«Ъ с ъ съ о

sn о

»О

1 .М

- о

N.Ф

ЗФ

° м ф СЧ,Ю «»4

° 0Ъ

1 !

«Ъ В

«Ъ о сч

»О «ч

1 1

00 »»

° . «ч

« Ъ

«Ч

Ф

1 о

0() 1 о

Сч СЧ

ct an

1 сч сса

О0 хР I ч х ф !

С! 1 ь сч

СЧ досч о со

Оо «СЪ л л

». «Ф

Щ «»

«С

an Со О СЧ

ССЪ СЧ Е0

C«I «СЪ о о съ м м

CL ««Ъ О

СЪ ., Э о л

1 1 1 м»с7

» ° С С

Ф !. о о сч . «ъ л cv

I 1 о ю

Ф» е о м сч.

»О . aCt « Ч

СЧ СЧ «СЪ !» ОЪ

СЧ «»Ъ

СЧ

° м сч «ч

Ф о сч

5 е

Я . Ь

6 Ф

Ф1 ю сч

М

С!

m 1» .aII !

0 СЧ

0 х

В б

ФФ 4 Р "

В

0! ф а а

ФЗ ф био о0353йФ чв «! съ с о о сч. съ

° Ь as a В а В Ф а о о о - о о

С0 - СЪ Л - CI О ъ с»

Ю - СЪ Ю ЧЪ CV

А А Ch eþ 4 м м Ь м Ь

С Ъ сч сч с ъ an сч «съ сч

f» а О

3в

O cO

53

С»

С» ss!

cJ «О о

Ц ф

Ф cl ф с» ° хоа

Ф а и

6Rф„ о ьыо

mVIC. ф ° а ф

Ф ф Ф а Э

1;" сфс о

31

L 0!

3.

I 122

822551

Таблица. 5

Число погибших (числитель) и выживших (знаменатель) мышей при внутривенном введении исследованных препаратов

Препарат ¹ серии

Нативная стрептокиназа 12500

О/6 О/6 О/6 О/6 О/6

Стабилизированная стрептокиназа 7.10.78

О/6 О/6

5250,О/6

О/6 О/6

Стабилизированная стрептокиназа 19. 10. 78

О/6 О/6 О/6

5250

О/6 О/6

Стабилизированная стрептокиназа 20. 10.78

О/6 О/6

5000

О/6 О/6 О/6

Иодифицированный декстран

О/6 О/6 О/6

О/6 О/6

Таблица 6

Анафилактогенные свойства стрептокиназы и микробных тромболитических протеиназ

Анафилактические индексы ферментов

Сексибилизирующая доза стрептокиназа

j ск террилитин гигролитин кг/белка

ИЕ кг

СКн кг

0,3

1,8

2,3

1,4

1,0

1,3

2,0

П р и м е ч а н и е: "-" — не определяли; "О" — анафилактическая реакция отсутствует. Подчеркнуты дозы соответствующие: максимальной, терапевтической (суммарно) = 1 85 млн ИЕ

250 тыс. ИЕ и минимальная исходнал„.терапевтическая по рекомендациям фирмы-изготовителя нативной стрептокиназы.

О, 1 31000 0,3

Оr5 15500 О

О, 13 4200 О

О 05 1550 О

О, 005 155 О.

Активность Дозы, мг/кг и результаты определений

ФЕ /мг

250 500 750 1000 2000

23 822551 24

Та блица 7

Иммунный ответ к модифицированной стрептокиназе у кроликов, иммунизированных нативным ферментом

Средние геометрические титры антител по срокам .(дни) Доза препарата СКм

МЕ/кг мг белка/кг

А. Без предварительной иммунизации препаратом СКн

3,2

3,2

0,05

1700

2,2

4200

3,0

0,13

1700

0,05

2,0

3,0

4200

0,13

2,0

2,2, 33000

1,0

2,8

3,8

Таблица 8

Резистентность плазмы крови кролика и нативной и модифицированной стрептокиназы

Иммунизирующая доза, МЕ/кг

Количество фермента (МЕ), связываемое 1 мл плазмы

Титры антител

СКн

СКм

1. Иммунизация нативным ферментом

16 Э 1000

12.

192

4200

4200

48

4200

1700

144

1 700

144

1700

12

192

2. Иммунизация препаратом СКм

31000

16

31000

16

31000

33000 1,0 2 6 3,0

Б. После предварительной иммунизации нативной стрептокиназой

26

822551

Продолжение табл.8

Количество фермента (МЕ), связываемое 1 мл плазмы

Титры антител

Иммунизирукщая доза, NE/êã

СКм

СКн

16

4200

5 3

4200

16

240

15.

4200

4200

16

Редактор О. Горькова Техред Jl.ÎëåéíèK Корректор М. Демчик

Заказ 4147/3 . Тираж 490

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие г Ужг П ород,ул. роектная, 4

П р и м е ч а н и е: "К" — отношение количеств СКм и СКн, связываемых

1 мл плазмы. Титры антител определяли в

РНГА. Соответствуют максимальным разведениям сывороток крови реагирующим с гомоголичным тестантителом.