Способ диагностики сифилиса
ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Соввтсккк Соцкалксткчвскки Реслублкк (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 18.06.79 (21) 2783656/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М. Кл. А 61 В 10/00 G 01 N 38/16 3Ъеударетееииый комитет COCI ае деизм изебретеиий и еткрмтий Опубликовано 30.05.81. Бюллетень №20 Дата опубликования описания 06.06.81. (53) УДК 616-002..6 (088.8) P. A. Капкаев, Ч. И. Бурштейн, Э. Г. Ким и С. А. (72) Авторы изобретения /;:j 1 Ташкентский государственный ордена Трудового К1таснога Знамени медицинский институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СИФИ, ЛИСА Изобретение относится к медицине и касается диагностики раннего врожденного Сифилиса. Известен способ диагностики сифилиса путем исследования нейтрофилов периферической крови (1). Однако способ не является строго специфичным, так как аналогичные изменения ферментов могут возникать и при других состояниях (различные инфекционные заболевания, болезни с обменными нарушениями и пр.) и не позволяет диагностировать заболевание на ранней стадии. Кроме того, спо.соб технически сложен и не всегда выполним в лабораториях общеклинического профиля. Цель изобретения — ранняя диагностика заболевания. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу диагностики сифилиса путем исследования нейтрофилов периферической крови кровь инкубируют с ультраозвученной бледной трепонемой и определяют показатель повреждения нейтрофилов и при показателях повреждения нейтрофилов от 0,2 до 0,4 диагностируют выраженные, а при показателях от 0,11 до 0,39 — косвенные признаки сифилиса. Способ осуществляют следующим образом. При постановке реакции для каждоп больного готовят ряд пробирок. Если используют один аллерген, то достаточно двух пробирок: опытной и контрольной. В контрольную пробирку стерильной микропипеткой вносят 0,02 мл 5%-ного раствора цитрата натрия, в опытную 0,02 мл трепонемального антигена, разведенного цитратом натрия по схеме: 0,8 мл цельного трепонемального антигена йлюс 0,2 мл 25%-ного цитрата натрия. Оптимальную концентрацию аллергена устанавливают опытным путем, что удовлетворяет основным требованиям реакции: не вызывает выраженной активности клеток здоровых людей (несенсибилиIS, зированных здоровых доноров) и обуславливает интенсивную амебоидную реакцию нейтрофилов крови высокосенсибилизированных больных, страдающих активным и формами первичйого и вторичного сифилиса с высоким титром реагентов в КСР и антител З в РИТ и РИФ. Для каждой опытной и контрольной пробы микропипеткой набирают 0,08 мл исследуемой крови,и вносят в околодонную часть 3206 Hi Ha оа Ф пробирки (первую каплю отбрасывают). Для получения антикоагулирующего эффекта йробирки слегка встряхивают, закрывают пробками и ставят на 2 ч в термостат при 38 . Пробирку, взятую после инкубации для приготовления мазков, снова слегка встряхивают в целях равномерного распределения лейкоцитов во всем объеме крови. Из каждой пробы делают по два мазка средней толщины. Для приготовления мазка используют химически чистые обезжиренные стекла. Подсушенные мазки подвергают в дальнейшем фиксации в спиртовом растворе нитрата кальция с добавлением к нему непосредственно перед фиксацией формалина (на каждые 100 мл 96 этилового спирта берут 1,8 азотнокислотной меди; 0,9 азотнокислого кальция и 10 мл 40О/р-ного формалина). Спустя 40 мин после погружения мазков в фиксатор их.отмывают от формалина в 3-х порциях 96 спирта (но 10 мин в каждой порции). Подсохшие мазки окрашиваются по методике А. Л. Шабодаша (гистохимическая реакция на.гликоген). Основные этапы окрашивания: инкубация (20 — 25 мин) в растворе периодата при комнатной температуре; промывание (2 — 3 мин) в дистиллированной воде; погружение на 20 — 25 мин в реактив Шиффа; обработка в 3-"х порциях сернистой воды (по 2 мин в каждой); трехкратное промывание в дистиллированной воде по 15 мин). 3аключительный этап — докраска ядер гематоксилинэозином Эрпиха. Оценка теста (показатель повреждения нейтрофилов ППН) предусматривает просмотр 100 нейтрофилов в контрольном и 100 в опытном мазках. При микроскопии нейтрофилы делят на две категории: нормальные и поврежденные с достаточно объективными проявлениями амебоидной реакции. Результаты подсчета обрабатывают по формуле где Н, — число поврежденных нейтрофилов в опыте; Н вЂ” число поврежденных нейтрофилов в контроле; 100 — количество просмотренных в мазке нейтрофилов. Для подтверждения специфичности изменений нейтрофильных лейкоцитов при их сенсибилизации к трепонемальному антигену проведено электронномикроскопическое изучение нейтрофилов, инкубированных с указанным антигеном, а также электронномикро скопическое, изучение ультраозвученного трепонемного антигена. С этой целью лейкоцитарную массу, выделенную из крови исследуемого больного, фиксируют в 2,5 /р-ном растворе глутаральдегида,45 мин с последующей дефиксацией 4 в /о-ном растворе Со$0„на фосфатном буфере 60 мин при 4 С. Обезвоживание образца производят в спиртах возрастающей концентрации, абсолютном ацетоне и заливаю в аральдит или эпон-812. Срезы, полученные на ультрамикротоме LKS-4800, контрастируют уранилацетатом и нитратом свинца и просматривают в электронном микроскопе «J ЕМ-7». Нормальные нейтрофильные лейкоциты характеризуются гладкой наружной мембраной с единичными небольшими отростками и вдавливаниями. Ядро сегментировано и на ультратонких срезах состоит из двух. трех сегментов. Ядерное вещество равномерно распределено по нуклеоплазме с концентрацией хроматина по периферии ядра у оболочки. В оболочке видны немногочисленные ядерные поры. В цитоплазме .нейтрофилов встречаются в большом количестве рибосомы и полисомы, отдельные профили гранулярного эндоплазматического ретикулума 20 и митохондрии. Последние имеют обычную структуру, некоторые из них с расщепленным матриксом. Наиболее характерной структурой цитоплазмы нейтрофилов являются разнообразной величины, формы и электронной плотности секреторные гранулы. Сенсибилизация нейтрофилов к трепонем- .ному антигену вызывает выраженные изменения клеточной поверхности и внутриклеточных структур. На наружной поверхности появляются ,зп многочисленные отростки длиной до нескольких микрон, инвагинации цитоплазмы, образования типа псевдополий. Эти изменения видимо свидетельствуют об усилении фагоцитарной активности нейтрофилов. В цитоплазме нейтрофилов, инкубированных с трепонемальным антигеном, появляются. многочисленные вакуоли размером от 0,5 до 10— 12 мкм, в отдельных случаях эти вакуоли занимают большую часть цитоплазмы. Содержимое вакуолей представляет собой электронно-светлые поля, на фоне которых различаются частички, представляющие собой клеточный детрит, отдельные мембранные комплексы и другие структуры. Проведенные электрднномикроскопические исследования взвеси ультраозвученного 15 трепонемного антигена показывают, что он представляет собой различной величины обрывки мембран, клеточный детрит и другие структурные образования, встречаемые в вакуолях нейтрофильных лейкоцитов. В исследованной взвеси трепьнемального антигена структурные компоненты располагаются в гораздо большей концентрации, чем в вакуолях нейтрофилов, что объясняется значительным разведением антигена, используемого в реакции. Проведенные электронномикроскопичес кие исследования позволяют утверждать, что нейтрофильные лейкоциты больных с врожденным сифилисом обладают способтельными серологическими реакциями (груп па 1), ППН находится в пределах 0,2-- О,- . я выше. В контрольной группе такие показатели отсутствуют вообще. Во 2-ой группе (дети с косвеннымн признаками заболевания и отрицательными серологическими реакциями) показатель лишь у 4-х детей находится в пределах 0,01 — 0,1, а у 12-ти (75+. 12,5) в пределах 0,11 — 0,39. При статистической обработке данных в сравнении с контрольной группой различия показателей (р = 5%) удовлетворительно достоверны. При сравнении данных первых двух групп по методу х различия показателей достоверны (р 0,05). В 3-ей группе (дети без.клинико-серологических проявлений) показатель у 29-ти (87,8 6,0) детей находился в предела х 0,01 — 0,19, у четверых — 0,2 — 0 39, В контрольной группе ППН был в пределах 0,01— 0,19 у 18-ти (100%) детей. При статистической обработке в сравнении третьей группы с контрольной результаты недостоверны. Отсюда видно, что величина показателя соответствует форме заболевания (0,2 и выше — выраженные формы, 0,11 — 0,39-формы с косвенными признаками). Предлагаемый способ дает возможность диагностировать сифилис на ранних стадиях, позволяя своевременно подвергнуть больного лечению. З Экономический эффект ранней диагностики выражается в возможности сэкономить медикаменты и сократить сроки нахождения больного в стационаре. Таблица 1 Нет Нет 4 25,0 10,9 1 6,25 6,05, 11 26 78,8 7,2 3 9,0 4,9 4 12,2+5,7 Нет Нет 11,1 7,4 Нет ностью фагоцитировать частички трепонемного антигена. Было обследовано 66 новорожденных, родившихся от матерей, больных сифилисом, и 18 новорожденных, родившихся от матерей с нормальным течением беременности. При этом все дети были подразделены на 4 группы. 1 Группа — дети с установленным диагнозом врожденного сифилиса (17); 2 Группа — дети с косвенными признаками, стигматами врожденного сифилиса: сомнительные серологические реакции, костные дистрофии, увеличение печени, селезенки, гипотрофия и пр. (16); 3 Группа — дети без клинико-серологических проявлений (33); контрольная группа — здоровые новорожденные (18). Сравнительные результаты приведены в табл. 1 и 2.. Сопоставление результатов исследования в указанных группах показывают, что самые высокие значения реакции ППН (от 0,11— 0,4) у детей с установленным врождением ° сифилисом и в группе детей с косвенными признаками врожденного сифилиса, в то время как у новорожденных без клиникосерологических проявлений значения ППН приближены к результатам контрольной группы. Из табл. 1 следует, что чем выше показатель повреждения нейтрофилов, тем вероятнее диагноз врожденного сифилиса. Так, в группе детей с ранним врожденным сифилисом, подтвержденным положиКонтрольная 16 88,9 7,4 2 76,5+10,2 4 23,5+10,2 68,75+11,6 Нет 833206 Таблица 2 Пределы колебаний ППН мкм у групп Показа тели 0,О!в -0,1,Il — О,l- 0,4 0,12 -0,39 и выше,01— Оз! 0,О!в -0,1 О,! 1 — 0,2- 0,3 -0,19 -0,39 и выше 0,11— -0,19 0,2- 0,4 -0,39 и выше 11,1 7,4 88,9 11,4 7,4 7,4 88,9 7,4 88,9 7,4 11,1 7,4 О О О О 00 00 30 30 30 30 30 43 30 30 1,2 O,l 2,2 0,6 5,9 92 Pb, Е 0,1 14 0,1 3 0,1 55 0,1 Формула изобретения Составитель С. Малютина Техред А. Бойкас Корректор Ю.Макаренко Тираж 687 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП «Патент». г. Ужгород. ул. Проектная, 4. Редактор Л. Пчелинская Заказ 3843/2 12 1,5 6,9 2,3 2,3 Способ диагностики сифилиса путем исследования нейтрофилов периферической крови, отлича>ощийся тем, что, с целью ранней диагностики заболевания, кровь инку° бируют с ультраозвученной бледной трепонемой и определяют показатель повреждения . нейтрофилов и при показателях повреждения нейтрофилов от 0,2 до 0,4 диагностируют выраженные признаки сифилиса, а при показателях повреждения нейтрофилов от 0,11 20 до 0,39 диагностируют косвенные признаки сифилиса. Источники информации, приНятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР № 577018, кл., Ci Ol N l(28, 1977.
