Способ получения плазмидной рекомбинантнойднк, содержащей гены рестриктазыи метилазы

 

Союз Советскиз

C N4tENCTHVOCKHX

Рес ублнк

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОУСКОМУ Св ЕТЕЛЬСТВУ

«i>852939

-e (61) Дополнительное к ввт. свмд-ву (22) Заявлено 1709.79 (21) 2822400/30-15 с присоединением заявкм Йо (23) Приоритет

Опубликовано 070881 Бюллетень N9 29

Дата опубликования описания 070881 (53)м. К,.3

С 12 N 15/00

ГосударстаеииыЯ комитет

С С С P оо девам изобретеииЯ и открыти Я (53) УДК s7s.173 (088. 8) (72) Авторы изобретения

В.Г.Косых, Я.И.Бурьянов н A.A.Áàåâ

Институт биохимии и физиологии микроорганиэмов

AH СССР (71) Заявитель (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЗМИДНОЙ PEKOMBHHATHOA

ДН К, СОДЕ РЖАЩЕ И ГЕ НЫ РЕСТ РИ КТАЗ Ы И МЕТИЛАЗЫ

Eco RII

Изобретение относится к области молекулярной биологии, в частности к генной инженерии, и представляет собой способ получения рекомбинатной плазмидной ДНК, содержащей гены рестриктазн и метилазы E<< RII, Известен способ получения плазмидной рекомбинатной ДНК, включающий обработку донорной и реципиентной

ДНК эндонуклеазой рестрикции, соединение полученных таким образом фрагментов с помощь полинуклеотидлигазы, трансформацию клеток Esherichid coIi рекомбинантными плазмндными ДНК и отбор трансформантов на селективной среде (1).

Цель изобретения — обеспечение суперсинтеэа рестриктазы и метилазы.

Для достижения цели в качестве донорной ДНК используют ДНК плазмиды

N 3, в качестве реципентной ДНК плаэмиды pIZ 203, а в селективную среду вводят ампициллин и сульфаниламид.

На фиг. 1 приведена диаграмма .вдектрофореза в агарозном геле EcoRI фрагментов ДНК фага h Ь и плазмид:

N 3, RSF 2124, pFK 321, цифрами обозначен молекулярный вес фрагментов

ДНК в мегадальтонах. На фиг. 2 дана схема плаэмиды pIZ 203/Ci 857, cro6/ с точкой рестрикции для EcoRI и генетической картой, Стрелками указано направление транскрипции. На фиг. 3 приведена диаграмма электрофореэа в агарозном геле EcoRI-фрагментов

ДНК Фаза% Ь и плазмид: N 3, рЕЬ

203, pSK 323.

Пример.

1. Выделение плазмидных ДНК.

Плазмидные ДНК получают центрифугированнем осветленного клеточного экстракта (2) с этидиумбромидом (3).

2. Конструирование рекомбинатных плазмидных ДНК.

15 ДНК плазмид рестриктнруют Е Rl в реакционной среде, содержащей 0,1 М трис-НС) рН 7,4, 0,01 М И9С!

0,05 М NaCI, 1 ч при 37 С. К гид.ролизату ДНК затем добавляют 1/10

20 объема . 5 М NaCI и осаждают 2,5 объемами этанола. Осадок ресуспендируют в лигазном буфере (0,666М .крис-HCI pH 7 5, 0,01M МЧСТр, 10

ЭДТА, 0,01 М дитиоэритритол, 100 мкг мл бычий сывороточный альбумин,10 М

АТФ) добавляют лйгазу и инкубируют о

10-24 ч при 10 С

3 Конструирование RSF2124 и 03 рекомбинантной ДНК. Высокоочищенные

ДНК RSF2124 и N3 рестриктнруют эндо8529 39 нуклеазой EcoRI. Продукты гидролиэа анализируют электрофорезом в 1%-ном агароэном геле. Для получения рекомбинантных ДНК проводят сшивку EcoRI7 фрагментов ДНК плазмид RSF2124 и NÇ

В реакцию берут 6 мкг ДНК RSF2124 и

4 мкг NÇ, после гидролиэа EcoRI u анализа продуктов гидролиэа электрофорезом смесь Фрагментов ДНК переосаждают спиртом, после этого осадою ресуспендируют в 100 мкл лигазного буфера и добавляют 2 мкл лигазы.

4. Трансформация и отбор клонов, содержащих рекомбинантные ДНК, Для трансформации получают клетки штамма Е.coIiC600 обработанные раствором СаС6 (4) .для проверки компетентности Са + клеток проводят трансфекцир ДНК фага лямбда. Эффективность инфекционности составляет

2-5 10 фаговых колоний мкг/ДНК.

К 100 мкл ДНК, полученной после Щ лигазной обработки, добавляют 200 мкл клеток, обработанных CaCIg, Смесь инкубируют 30 мин при 00С затем 2 мин при 420 C и 10 мин при 24о С Добавляют 2,7 мл питательного бульона, инкубируют 30 мин при 37оС с аэрацией. Суспензию высевают на чашки с антибиотиками (ампициллин 25 мгк/мл и колицин в соответствующем .разведении)

Выросшие колонии проверяют на способность синтезировать колицин, для этого их перекалывают на чашки, подращивают б ч при 37оС, облучают УФсветом 30 с и засевают чашки индикаторной культурой Е.coIiC 600. Отобранные клоны, не синтезирующие колицин, после перечисленных операций затем проверяют на способность рестриктировать и модифицировать фаг лямбда, 1

5, Анализ клонов, содержащих

RSF 2124 и ИЗ рекомбинантную ДНК.

Отобранные клоны проверяют на рестрикцию и модификацию системой

EcoRII. Степень рестрикции фага лямбда, выращенного на штамме С600 фф (г+ т ), определяют сравнением титра фага при посеве его на штаммы

E,coIiC 600 (г+ m+ ) и Е,coIi НВ1100 (r щ+ ) NÇ и клойы, содержащие рекомбийантные плазмиды. При высеве Фа" щ га на клоны, содержащие рекомбинатные плазмиды, несущие гены Е RII, они ограничивают рост по сравнению со штаммом С600 на два порядка, как и штамм НВ 1100/НЗ. Фаги, выросшие на этих клонах, содержащих рекомбинантные плаэмиды, высевали на штамм

С600 и штамм HB1100/ИЗ. Фаги, выросшие на клонах, содержащих рекомбинантные плазмиды, несущие гены

EcoRII, дали одинаковый титр как на 40 штамме С600, так и на штамме НВ

1100/ИЗ. В табл, 1 показаны данные рестрикции и модификации одного кло« на, содержащего рекомбинантную ДНК с генами EcoRII, обозначенную как 4$

pFK 321, При проверке этих клонов на устойчивость к антибиотикам, которые, несла плазмида NÇ, они показывают устойчивость к сульфаниламиду.

Таблица l

Эффективность рестрикции и модификации Фага клетками Е.co/i

Специфичность фага

Ффективность раэмноже ия фага на клетках

600 НВ1100 С600 п к) (r m ê„) (m ) N3 pFK321 h Ñ600 (х„m ) 1 ° 10 1 ° 10 " НВ1100 (r„m+ )/N3

>" C600 (r„m„)

pFK321

6. Рестрикция рекомбинатных плазмид.

Из полу че н ных клонов выдел я ют плазмидную ДНК и подвергают рестрикции эндонуклеазой EcoRI 1 ч при 37 С, затем смесь подогревают при 600С

l0 мин, добавляют глицерин до конечной концентрации 20% с бромфеноловым голубым (0,001Ъ}.

Образцы после гидролиза наносят на

1%-ный агарозный гель и проводят злектрофорез при напряжении 10 В/см в течение 2 ч. Используют электрофоретический буфер 0,04 M трис-ацетат, рН 8,00,002 С ЭДТА, 0,002 М ацетат натрия. Гель окрашивают этидиумбромидом и фотографируют в проходящем УФ-свете.

Картина электрофоретического разделения фрагментов ДНК показывает, что рекомбинатная плазмида состоит из вектора НЯГ2124 и включенного в него фрагмента плазмида ИЗ, молекулярный вес которого составляет 6,0 ° 1(f дальтон (фиг. 1) .

7. Клонирование генов Ес,й11 в векторе pIZ203.

Обнаружение после клонирования

Eoo RI фрагмента плазмиды NÇ с генами

Е o RII свидетельствует о том, что этот Фрагмент наряду с генами Е Н11 несет устойчивость к антибиотику сульфаниламиду, это дало возможность клонировать этот фрагмент в векторе

pIL203, который не имеет селекции при встройке чужеродных Е Н? Фрагментов, если эти Фрагментй не несут селектируемых маркеров. Вектор p3L

203 получен на основе плазмиды PBR и ВахпНХ-Е Н1 Фрагмента Фага лямбда, в котором находятся левый и правый промоторы, кроме того, в этом фрагменте содержится температуроччвстви852939 к понижению репрессии транскрипции с фаговых промоторов. В зависнмостй от бактериального штамма наличие продукта гена CR0 колеблется от 1 (полная супрессия) до уровня 10 (5j.

Таким образом, можно увеличить транскрипцию как за счет температурных условий культивирования, так и эа счет использования штаммов Е coIi содержащих различные супрессоры, для трансформации рекомбинатной плазмидой.

Трансформировали рекомбинатную плазмиду pSK 323 в штампы ElcoIi, несущие различные супрессоры. После выращивания этих штаммов при 37 С

15 (при этой температуре резко снижен синтез репрессора Ci) была проанализирована активность рескриктазы и метилазы Ео RII в бесклеточных экстрактах. этих штампов.

2О 9. Определение активности рестриктазы и метилазы Eco RII. тельная мутация в гене репрессора

Ci и супрессируемая аббер-мутация в гене cro, Таким образом, используя вектор pIL203, можно увеличить дозу и количество транскриптов клонируемых генов.

Плаэмидные ДНК ИЗ и рП, 203 получают центрифугированием в CsCI, рестриктируют эндонуклеазой E RI u анализируют рестриктированную ДНК электрофореэом в агарозном геле (фиг. 3) . Рестриктированные ДНК N3 (4 мкг) и pIL 203 (4 мкг) смешивают, переосаждают спиртом и ресуспендируют в лигаэном буфере. После добавки.лигазы (2 мкл) смесь инкубируют

1б ч при 10ОС. Лигированную ДНК трансформируют в ElcoIi(802/г„ m< ).

Трансформанты отбирают по устойчивости к ампициллину и сульфаниламиду.

Выросшие колонии проверяют на способность рестриктировать и модифицировать фаг лямбда. Таким образом, отбирают клоны, которые проявляют устойчивость к ампициллину и сульфаниламиду и могут рестриктировать и модифицировать фаг лямбда со специфичностью системы E<>RII. Данные по рестрикции и модификации клона, несущего такую рекомбинантную ДНК, обозначенную как pSK 323, представлены в табл. 2.

ЗО

4$

56

$S

Таблица2

Специфичност ь фага%

02 802 802 (r„m„) (r„m )

pSX323

-2 -2

1 1i10 1 10

А .802 (r,т„) A ° .802 (r„m+ )

pSK323

1 1

Эффективность рестрикции и модификации фага клетками Е,со) ффективность размноения фага на клетках

802 (r m+„) N3 1 1

Выделения плазмида ДНК из этого клона после рестрикции эндонуклеаэой

EC RI образуют два фрагмента при электрофорезе, соответствующие по молекулярному весу вектору pIL 203 и фрагменту плаэмиды N3, молекулярный вес которого б,О 10 дальтон.

8. Экспрессия растриктазы и метилазы Е RII в штаммах, содержащих рекомбйиантную плазмиду pSK323.

Плазмида pIL 203, используемая в качестве донора при получении рекомбинатной ДНК pIL 203-3, несет термочувствительную мутацию в гене репрессора Ci и супрессируемую аббермутацию в гене CR0, которые приводят

Клетки Е.со!(выращивают до поздней логарифмической фазы. Клетки собирают центрифугированием и ресуспендируют в PENg буфере (0,01 М

К РО,, рН 7,0 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 5% глицерин) . Клетки разрушают ультразвуком. После разрушения центрифугируют при 100000 g

1 ч при 4оС. Бесклеточный экстрат используют для определения ферментативной активности. Активность метилазы определяют в реакционной смеси общим объемом 150 мкл, содержащей

40 мМ КНРО„ рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, 7 мМ

2-меркаптоэтанола, 20 мкг ДНК спермы лосося, 4 мкМ (метил-Н ) Я-аденозилметионина и 50 мкл фермента при различных разведениях . Реакцию прово- дят при 37 С в течение 1 ч, добавляют равный объем 0,75 М натриевой щело чи, инкубируют 30 мин при б()бС. Затем к пробам добавляют 2 мл Н О и

2 мл 10% ТКУ. Осажденную ДНК наносят на фильтры, промывают 0,01 N HCI u спиртом. После просушки фильтров считают радиоактивность. Для определения специфичности включения метки в азотистые основания ДНК последнюю элюируют с фильтров, гидролиэуют до азотистых оснований 57%-ной хлорной кислотой и азотистые основания разделяют хроматографией на бумаге.

Радиоактивность азотистых оснований определяют в вырезанных образцах бумаги (б). Активность рестриктазы

EcohR1I .определяют в буфере), содержа» щем 1 мкг ДНК плазмиды рВЯ322, 50 мМ трис-HCI рН 7,5, 10 мМ NgCI, 10 мМ

2-меркаптоэтанола 1 мМ ЭДТА и фермент в различных разведениях. Общий объем смеси составляет 40 мкл, реакцию проводят при 37оС 15 мин. Полученные фрагменты ДНК анализируют электрофоре зом в 1%-ном агарозном пластинчатом геле и трис-ацетатном буфере (6) 852939

Как видно иэ этих данных, наибольший синтез рескриктазы н метилазы наблюдается, когда рекомбинантная плазмида находится в штамме W 3350 (Srr ), Акти вност ь рескри ктазы и ме тилаэы в этом штамме в 15 раз увеличена по сравнению с контрольным штаммом W 3350/N3/, Таким образом, полученная рекомбинантная плаэмидная ДНК, несущая гены рестриктаэы и метилазы ECORII, содержащаяся в различных штаммах

Е.со!i îáåñïå÷èâàåò суперсинтез ферментов EggRII бактериальной клеткой, Штампую с ктивность, плаэмидо мп мин/мг

ИЭ елка

Штаммы Актив-, с плаз- ность, мидой имп мин

pSK323 мг белка

Формула изобретения

17 106

7,2»10 20

Таблица 4

Активность рестриктазы Е RII в в бесклеточных экстрактах штаммов, содержащих плазмиду БЭ и pSK 323

Активзо в 1 мл

W 3350 3200 (Su ) 200

W 3350 (Su ) С R 63 2000 (Su Ц

802 1500 (SuII I) 200

С R63 (SuI) 802(SuIII) 200

1975, 4.

1970, 5. т, 24

1977, За единицу активности фермента ,принимали количество фермента E RII, gc которое необходимо для полного гидролиза 1 мкг ДНК плаэмиды pBR 322 в течение 15 мин при 37ОС.

Результаты этих опытов представлены в табл. 3 и 4.

Т а б л и ц а 3

Активность метилазы Е В1Е в бескле. точных экстрактах штаммов, содержащих плазмкду N3 и pSK 323.

W3350 (Su" ) 1,5i10 И 3350 20,8 20 (Sua

С R 63 (SuI) 1»6 С R 63 (Su I) Ъ

802 (SuIII) 1, 1 ° 106 802 (SuII I) 1

»(Штаммы с Активность Штаммы плаэмидой в 1 мл с плаз

БЭ мидой

pSK323

Способ получения плазмидной рекомбинатной ДНК, содержащей гены рескриктазы и метилазы Е В1?, включающий обработку донорной и реципиентной ДНК, эндонуклеаэой рестрикции, соединение полученных таким образом фрагментов с помощью полинуклеотидлигазы, трансформацию клеток Еscherichia coll рекомбинатными плазмидными

ДНК и отбор трансформантов на селективной среде, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью обеспечения суперсинтеза рестриктазы и метилазы, в качестве донорной ДНК используют

ДНК плазмиды N3, в качестве реципиентной ДНК плазмиды pZ203, а в селективную среду вводят Ъмпициллин и сульфаниламид, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Заявка Франции 1Ф 2281426, кл. С 12 К 3/00, 1976.

2. Guerry Р. et аХтЭ. Bacter., 1973, v,116, 1064-1066

Tanaka Т. eta1- Э.Bacter, 121, 354-362, NandeI N, etaI.- j.MoI. Biol

V.5, 159-162.

Солонин и др. ДАН СССР, 19 79, 5. 722-725.

Бурьянов И.И. и др. ДАН CCCP т. 237, 465-468.

8529 39

Составитель Т.Тулякова

Редактор Е. Корина Техред М. Табакович Корректор Ю. Макаренко

Закаэ 5593/4 Тираж 528 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам иэобретений и открытий

213035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Я Р1

ЛЧ ЯМ2 24 ржУР1

I I