Способ определения концентрации ингибиторов биологической активности

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1 865904 (6l) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 07.04. 80 (21) 2909980/30-15 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет—

Опубликовано 23.09 ° 81 ° Бюллетень № 35

Дата опубликования описаьия 25 ° 09 ° 81 (5l )NL. Кл.

С 12 О 1/26

С 12 N 9/02 Ъоудвретвкииый комитет

СССР

lo делан изобретений и открьпий (S3) УДК543.9т

:543.4,42 (088.8) (72) Авторы изобретения т

В.А. Кратасюк, А.N. Кузнецов, А.И. Фиш и И.И. йительзей ..

I ) <

Институт физики им. Л.В. Киренского Сибирског

АН СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИНГИБИТОРОВ

БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения концентрации ингибиторов биологической активности (ароматических веществ) — пестицидов, фунгицидов, канцерогенов, веществ, являющихся компонентами сточных вод промьшцтенньтх предприятий.

Известен способ количественного определения ингибиторов биологической тО активности путем измерения максимальной интенсивности свечения при обработке анализируемой пробы реакционной смесью, содержащей люциферазу и ее субстраты (1) и 12 J, Однако чувствительность этого метода недостаточна, так как максимальная интенсивность свечения имеет низкую чувствительность к малым концентрациям ингибиторов, а величина этого пара20 метра варьирует при незначительных колебаниях концентрациЪ компонентов реакций.

Цель изобретения — увеличение чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что анализируемую пробу обрабатывают реакционной смесью, содержащей дополнительно к люциферазе и ее субстратам НАДНтФМН-оксидоредуктазу и ее субстраты в насыщающих концентрациях, а количество ингибитора определяют по времени достижения максимума биолюминесценции.

П р н м е р. Для определения концентрации 2,4-динитрофторбензола в растворе строят калибровочную кривую.

Дпя этого используют препараты люциферазы, содержащий активность

НАДН:ФИН-оксидоредуктазы, полученный из бактерий рода Photo bacterium согласно методике, ограничиваясь стадией высаливания сульфатом аммония. Приготавливают раствор, содержащий 0,01 мл препарата люциферазы и НАДИ-ФМН-оксидоредуктазы (1,28 мг белка в 1 мл препарата, 0,086 мл 5-10 М раствора

865904

-Э

ФИН, 0,08 мл 6„4 10 М суспензии н-де каналя, полученной озвучиванием при

800 кГц в течение 30 с 0,16 мл 10 М

2 фосфатного буфера рН 6,8 в общем объеме 1, 2 мл. Свечение начинается при добавлении к этому раствору

0,4 мл 4 10 М раствора НАДН. Реак-4 ционная смесь барботируется воздухом. Реакцию проводят в термостатируемой кювете при 20 С, измеряют, время достижения максимальной интенсивности свечения в реакционной смеси без вещества — 80 с. Ошибка при измерении йщ<э„-+ 1,5Х. При внесении в реакционную смесь 1 10, 1 10

5-10 1, 10 М 2,4-динитрофторбенэола t = 97,118,204,240 с соответств Ох венно. По этим данным строят калибровочную кривую. При добавлении в реакционьую смесь неизвестного количе< тва 2,4-динитрофторбензола измеряют Ф и сравнивают измеренную

Фи СФх величину с калибровочной кривой.

Так, если t Й7 с, концентрация

2,4-динитрофторбенэола в растворе равна 2,4 10 М, Аналогичным образом проводят построение калибровочных кривых для определения и бензохинона и толухинона.

На фиг ° 1 изображена динамика интенсивности биолюминесценции в реакционной смеси, содержащей люциферазу и ее субстраты (Б), и в. реакционной смеси, содержашей дополнительно НАДН:ФМН-оксидоредуктаэу и ее субстраты (А ) на фиг. 2 — изменение динамики интенсивности свечения при действии разных ингибиторов биологической активности, А. 2,4-Динитрофторбензола в кон-б центрациях О, 5 10 М, 1, 25- 10 М, 510И,1 2510Ъ,2510М,410М (кривые 1-7 соответственно) .

Б. п- Бензохинона в концентрациях

О, 1,25 1ОМ, 1,25 ION, 3 10 М, 6,25 10 М (кривые 1-5 соответственно).

В» Толухинона. в концентрациях

О, 1,25 ° 10+Ì. 1,25 10 М, 1,25 10 М (кривые 1-4 соотве. ственно).

Предложенный способ позволяет увеличить чувствительность иэмерений

10 концентраций веществ по сравнению с известными способами. Предложенный способ является экспресс-методом анализа, прост, не требует сложного оборудования и дорогостоящих материалов и реактивов, доступен для заводских лабораторий. Способ может быть использован для определения степени загрязнения водоемов и сточных вод сулфатцеллюло-Мах и других предприятий.

Формула изобретения

Способ определения концентрации ингибиторов биологической активности

1 включающий обработку анализируемой

25 пробы реакционнои смесью, содержащей люцифераэу и ее субстраты, о т л и.ч а ю шийся тем, что, с целью повыШения чувствительности анализа, в реакционную смесь добавляют НАДН:

ФМН-оксидоредуктазу и ее субстраты в насыщенных концентрациях, измеряют время достижения максимума биолюминесценции и по его величине определяют концентрацию ингибитора.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Hastings I. W. Biochemistry, 1975, 14, Il 19, р.4310-4316 (прото40 тип 7 .

2. Hastings I,W., Ri l ley W.H., Hassa ). j. Biol, Chem, 1965.

240, р. 1473-1481.

865904

l3;

Ъ р50

Ф2

Ъ

ЮО

Z 3 4 Х 6 7 8 9 бремен, мин

Фиа2

В11ИИПИ Заказ 7991/38 Тирам 531 Подписное

t A

Филиал ЛГ1П Патент,г.ужгород,ул.Проектная,4