Способ определения брадикинина в сыворотке крови
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Советски н
Социалистических
Республик
<11>880411 (6l ) Дополнительное к авт. свид-ву (22) ЗаЯвлено 28.04. 80 (21) 29173Q3/3Q 15 с присоеаинением заявки йв— (23) Приоритет— (SI)M. Кл.
А 61 В 10/00
G 0I N 33/48 (Ьеударственны11 квинтет
СССР во делам нзебретеннй н юткрытнй (53) УДК 543.9:
:611-018 ° 5.
° (088.8)Опубликовано 15.11 81 Бюллетень М 42
Дата опубликования описания 15. 11. 81
72) Авторы (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БРАДИКИНИНА
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики патологических состояний организ ма.
Известен способ количественного определения брадикикина в плазме крови биотестированием на роге крысиной матки. Количество брадикинина данным способом определяют путем сравнения амплитуды сокращения гладкомышечного препарата рога крысиной матки под действием брадикинина плазмы и брадикинина-стандарта (1).
Однако данный способ не всегда позволяет определить концентрации пептида иэ-за низкого содержания бра15 дикинина в плазме крови, особенно в случаях резкого преобладания про-, цесса кининоразрушения над процессом кининообразования. Вводить же плазму в черезмерно большом объеме в питательную среду с тест-органам нельзя, так как максимальное количество вносимой плазмы лимитируется обоскованными требованиями относительного постоянства суперфузионной среды: рН питательного раствора, ионный состав, ионная сила, окнотическое действие и т.д. Введение больших объемов плазмы (1:1, 1:2) приводит к резкому сдвигу в составе суперфузионной среды, что отрицательно сказывается на сократительных свойствах гладкомышечного препарата.
Цель изобретения — повышение чувствительности способа и уменьшение необходимого для анализа объема плазмы крови.
Поставленная цель достигается тем, что перед введением в суперфузионную среду с гладкомышечным препаратом брадикинина плазмы и брадикинина стандарта в нее вводят гепарин в количестве 0,05-5,0 ед/мл.
Пример . Известными приемами осуществляют забор крови, подготовляют гладкомышечный препарат рога крысиной матки и устанавливают порог
880411
15 где А — количество брадикинина-стандарта, внесенного в среду с тест-органом, гг;
Б — количество плазмы, внесенное в среду с тест-органом, мл;
Н г амплитуда сокращения под действием внесенной плазмы, мм; 35
Н вЂ” амплитуда сокращения под дей5Р. ствием внесенного брадикинина-стандарта, мм.
В табл.1 представлены пороговые концентрации стандартного брадикини-. на, индуцирующие сокращения гладкомышечного. препарата рога крысиной матки в динамике с интервалом 30 мин.
Из табл.1 видно, что чувствительность рога крысиной матки к брадикини- 45 ну триацетату при биотестировании не изменяется на протяжении 3 ч.
В табл.2 даны пределы эффективных концентраций гепарина при выявлении их потенцирующего эффекта на сократительные свойства гладкомышечного препарата рога крысиной матки, индуцированного брадикинином триацетатом.
Таким образом, из табл.2 видно,что диапазон эффективных концентраций . гепарина при биотестировании(бради40 его чувствительности, внося в суперфузионную среду с тест-органом нанограммовые количества брадикинина триацетата (стандарт) . Затем определяют диапазон потенцирующих концентраций гепарина для данного тест-органа созданием конечной концентрации гепарина: 0,001, 0,005, 0,01, О,1, 1,0, 5,0, 50 0 500 0 ед/мл с последующей регистрацией пороговыхи сверх-, 10
I пороговых концентраций брадикинина.
Степень потенцирования определяют сравнением амплитуды сокращения тесторгана на одинаковые количества активного пептида в среде гепарина и с предварительным введением гепарина.
Далее выбирают диапазон максимально потенцирующей концентрации и проводя биотестирование плазмы введением в среду с гепарином определенного, 20 объема плазмы в сравнении со стандартным брадикинином, также протестированным в среде той же концентрации гепарина, Количество брадики— нина в плазме определяют по формуле, д пг/мл: A Н
5 .Н
ГК кинина триацетата. равен 0,000150,0 ед/мл. Максимально потенцирующие концентрации 0,01, 0,05 ед/мл.
В табл.3 приведены пределы эффективных концентраций гепарина при выявлении их потенцирующего действия на сократительные свойства гладкомьппечного препарата рога крысиной матки, индуцированного брадикинином плазмы крови.
Таким образом, из табл.3 видно, что диапазон эффективных концентраций гепарина при биотестировании плазмы крови равен 0,05-5,0 ед/мл.
Максимально потенцирующие концентрации — 0,05; 0,5 ед/мн.
В табл.4 представлены сравнительные данные биотестирования брадикинина плазмы крови с использованием потенцирующего эффекта гепарина в сравнении с общепринятым методом.
Из табл.4 видно, что при исполь- . зовании гепарина в конечной концентрации 0,05-5,0 е мл амплитуда сокра.— щений значительно превышает амплитуду сокращений, полученных биотестированием обычным методом. Максимально эффективные концентрации гепарина
0,05; 0,5 ед/мл.
В табл.5 дан порог чувствительности гладкомышечных препаратов рога крысиной матки к брадикинину триацетату при использовании потенцирующего эффекта гепарина в сравнении с общепринятым методом.
Из табл. 5 видно, что чувствительность тест-органов к брадикинину триацетату при использовании гепарина в конечной концентрации 0,05 ед/мл повышается в 2-8 раэ.
В табл.6 приведен порог чувствительности гладкомышечного препарата рога крысиной матки к брадикинину плазмы крови при использовании потенцирующего эффекта гепарина в сравнении с общепринятым методом.
Таким ооразом, из табл.6 видно,что чувствительность тест-органов к бради- кинину плазмы крови при использовании гепарина в конечной концентрации
0,05 ед/мл повышается в 2-6 раз по сравнению с биотестированием обычным методом. Минимально необходимый объем плазмы уменьщается также в 2-6 раз (0,5-0,25)мл против 1,0-1,5 мл плазмы при биотестировании обычным методом
880411
50,0
100,0
100,0
50,0
100,0
I00,0
50 0
100,0
100,0
50,0
100,0
100,0
50 0
120
100,0
100,0
50,0
150
100,0
100,0
50,0
180
100,0
100, 0
Таблиц а 2
14
0,000001
14 .
15
0
0,0001
500,0
500,0
500 0
500,0
Табли
0,0001-0,01
8804 1 I
Внесено в питательную среду в конечной концентрации
Амплитуда сокращения, мм
Равность амплитуд сокращений, мм
Брадикинина, пг/мл
0,0) +6
19
1,0 — 16
50 0
0,0005
5,0
50,0
0,005
50,0
50,0
0,05
50 0
50,0
0,5
50,0
0,005-50,0
100,0
100,0
5,0
100,0
100,0
50 0
100,0
100,0
500,0
I00,0
100,0
0,0005
100,0
100, 0
0,005
0,005-5,0
100,0
100;0
0,05
Гепарина, ед/мл
500,0
500,0
500,0
500,0
Продолжение табл.2
Эффективная концентрация гепарина, ед/мл
Продолжение табл, 2
Тест
Внесено в питательную среду в конечной концентрации орган, Ф
Гепарина, ед/мл
Брадикинина, пг/мл
+26
0,05
200,0
200,0
5,0
50 0
Таблиц а 3
Внесено
Внесено гепаплазмы, / мл
1,0
1,0
0,005
1,0
1,0
0,05
l 0
1,0
0,5
0,05-0,5
1,0
1,0
5,0
l,0
1,0
50,0
1,0
1,0
500,0
Тестор ган, 11 рина в конечной концентр ации, ед/мл
200, 0
200,0
200,0
200,0
880411
Амплитуда ,сокращения
Амплитуда сокращения, MM
Разность амплитуд сокращений, мм
Разность амплитуд сокращений 9 мм
Эффективная концентрация гепарина, ед/мл
Эффективная концентрация гепарина, ед/мл
8804)) l2
1,0
0,005
1,0
1,0
0 05
1,0
0,05-5,0
1,0
0,5
1,0
),0
5,0
1,0
1,0
50,0
1,0
1,0
),0
500,0
Таблица 4
БиотесРаэность амплитуд, Внесено тирование, 9 в конечной конплазмы,мл
1 а+
1,0
13
1,0
1,0 б 0,5
1,0
1,0
l0
),0 б 5 0
1,0
1,0
1,0
1,0
)2 гепарина центрации, ед/мл б 0,05
2 а 0
3 а О
4 а 0 б 0,05
5 а 0 б 0,05
Амлитуда сокращения, мм
Продолжение табл. 3
880411
Продолжение табл.4
Внесено
Биотесаэность мплитуд, мм азмы,мл
6 а 0
1,0
10
1,0 б 5,0
0 5
7 а 0
0,5 б 0,05
8 а 0
0 5 б 005
0,5
0,5
9 .а 0
0,5 б 0,05 а — биотестирование общепринятым методом;
%% б — биотестирование с использованием потенцирующего эффекта гепарина.
Т аблиц а 5 а» 0
10
20
40
1 б + 0
10
0 05
50 а 0
100
100
50
2 б 0
0,05
12
50 а 0 тирование, Р
Тест-, орган, В гепарина в конечной концентрации, ед/
Внесено в конечной концентрации гепарина, брадикинина, ед/мл пг/мл
Амплиту сокраще ния мм
Амплитуда сокращения, Порог чувствительности тест-органов, пг/мл
880411
1б
Продолжение табл. 5
Амплитуда сокращения, Внесено в конечной
Порог чувствительносконцентрации ти тест-органов, пг/мл брадикинина, пг/мл гепарина, ед/мл
100
0. 0
200
200
3 б 0 50
0,05 50
50
100
100
50
0 05
50 а 0
50
50 б 0
25
0,05
25 а 0
100
100
12 б 0
50
0,05
50
10 а 0
0
40
80
7 б 0
10
0;05
10 а+- порог чувствительности .при биотестировании обычным методом;
У"1- порог чувствительности при использовании потенцирующего эффекта гепарина.
Тесторган, Р а 0 б 0 б 0
880411
Таблица 6
Внесено
Тесторган, У гепарина плазмы, в конеч- " мл ной кон0,25 18
1,0 (72) а+ 0
0,5
1,0
72
0,5 (36) 0,5
36
0 05
0,5
0 а 0
0,25
1,5 1!08) 0,5
1,0
108
1,5
0,25 (18) 0
0,25
0,25
0 05
l8 а 0
0,25
1,0 (72) 0,5
72
),0
0,5
0,5 (36) 36 б 0,05
0,25
0 5
I,0
10.
108
1,5
0,25 (18) 18
0,25
0,25
0,05 а 0
0,25
0,5
I,0
108
1,5
0,25 (18) 0,25
18
0,25
0,05 центрации,ед/мл
1 б » 0
2 б 0 а 0
4 б 0
5 б 0 бр адикинина, мг/мл
Амплитуда сокращения мм
Порог чувствительности тест-органов в мл плазмы и пг брадикини--. на/мл плазмы
1,5 (108) 1,5 (108) 19
880411
Продолжение табл. 6
ТестВнесено
Амплитуда сокращения мм
Порог чувствительности орган, Р бр адикинина, мг/мл гепарина в конечной контест-органов в мл плазмы и пг брадикинина/мп плазмы плазмы, мл центр ации, ед/мл
18 а 0 025
0 0,5
0 1,0
0 1,5
1,5 108
0,25 18
72!
108
10
18
l,0 (?2) 36
0,5 36
36
0,05
a -. порог чувствительности при биотестировании обычным методом; б — порог чувствительности при использовании потенцирующего эффекта гепарина.
Формула изобретения
Составитель П.Рубинова
Редактор К.Волощук Техред С.Мигунова Корректор 1О.Макаренко
Заказ 9788/8 Тираж 690 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, -35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 б 0 0,25
0,05 0,25 а 0 025
0 0,5
0 1,0 б 0 0,5
Способ определения брадикинина в сыворотке крови, включающий введение в суперфузионную среду с гладкомьппечным препаратом брадикинина плазмы и брадикинина стандарта, измерение соответствующих амплитуд сокращений гладкомышечного препарата и их сравнение, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и уменьшения необходимоro для анализа объема плазмы крови,перед введением в суперфузионную среду с гладкомышечным препаратом брадикинина плазмы и брадикинина-стандарта в нее вводят гепарин в количестве 0,05-5,0 ед/мл.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Современные методы в биохимии.
M., 1968, с. 208-213.
