Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата руссулин

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ («>883)74 (61) Дополнительное к авт. свид-ву

{22) Заявлено 31 . 03. 80 (21) 2903964/28- ) 3 с присоединениеи заявки,)(й(— (23) П риоритет—

Опубликовано 23.11.8). Бюллетень )()е 43 (5l)M. Кл. С 12 и 9/50//

A 23 С 19/032

1аоудвратвенный квинтет до девок изобретений и открытий (53) УДК576.15. .08(088.8) Дата опубликования описания 23 . 11 .8

II

В. М. Гуцалюк, В. P. Кулинченко, М. Н. I 1)ульга,, )

Е. Е. Каталевский, Н. П. Кру глова, П.! g (d Ертихов, А. Е. Епифанов и П. Н. Ручков

ЫЫ (. : ;,,„„:, (72) Авторы изобретения

Киевский технологический институт пищевой промышленности (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩЕГО ФЕРМЕНТНОГО

ПРЕПАРАТА РУССУЛИН

Изобретение относится к производству микробиальных заменителей сычужного фермента для сыродельной промышленности, Известен способ получения фермента медицинского назначения Рудслина, пре-. дусматривающий культивирование продуцента Russulа deco)orans (штамм 2) на жидкой питательной среде, в состав которой вводят 5,0-20 г/л кукурузной муки. После осаждения эталоном белко†.

)0 вый раствор смешивают с фракционированной микрокристаллической целлюлозои из расчета 8,5-11,5 г/л и фильтруют с использованием нетканых материалов из полипропилена, а фильтрат под)$ вергают ультрафильтрации 11).

Недостаток известного способа— сложность технической схемы обусловВ

20 ленная необходимостью получения высокоактивного препарата, а также низкая эффективность процесса ультрафильтрации водных экстрактов фермента.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения молокосвертывающего ферментного препарата Руссулин, предусматривающий культивирование его продупента Ъ(зэк)а deco)orans (штамм 2) на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходи мые минеральные соли в условиях аэрации с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и его сушкой E2j.

Недостаток известного способа— его низкая эффективность и небольшой выход фермента.

Целью изобретения является упрощение способа и увеличение выхода фермента.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу, предусматривающему культивирование его продуцента

Russul a decbl orans (штамм 2) на жидкой питательной среде, содержащей исФ точники углерода, азота, необходимые

88317

55 минеральные соли в условиях аэрации с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и его сушкой, выделение ферментного препарата проводят путем ультрафильтрации фильтрата культуральной жидкости до содержания сухих веществ

4-6% с последующей распылительной сушкой ультраконцентрата при рН 5,05,5, причем для мембран на основе аце- 10 тата целлюлозы рН ультрафильтрации устанавливают 5,5-5,7.

Кроме того, при содержании фермента в грамме сухих веществ фильтрата культуральной жидкости 30-60 тыа. ед, полученный ультраконцентрат диафильтруют водой с рН, равным рН ультраконцентрата, до удельной активности фермента

125-130 тыс. ед./г с последующей ультрафильтрацией диаконцентрата или его непосредственной подачей на сушку.

Технология способа состоит в сле— дующем.

Культура высшего базидиального гри— ба Russulа decolorans (штамм 2) выра— щивается на питательной среде, содержащей, 7.: кукурузная мука 1,0-1,8; гидролизные дрожжи 0,2-0,3; калий хлористый О,1; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,4-0,06; калий фосфорнокислый двухзамещенный 0,02-0, )4; магний сернокислый 0,05-0,07; натрий азотнокислый 0-0,3; рН питательной следы 5,3-5,5, температура ферментации 25-26 С, избыточное давление 0,030,05 МПа, подача стерильного воздуха в количестве 0,5 объема на один объем среды в минуту. Продолжительность процесса ферментации 110 †1 ч.

После ферментации получаем культуральную жидкость с грибным запахом, светло-коричневого цвета, имеющую во взвещенном состоянии гифы мицелия гриба в виде шариков или нитей различной величины в количестве 4-7 г/л, рН 3,55,0; молокосвертывающая активность (MA) 400-200 ед/мл. Культура гриба охлаждается до 18-20 С и освобождаето ся от мицелиальной массы фильтрацией через плотную ткань типа "бязь". Отделенную от культуральной жидкости 50 биомассу сушат с целью ее дальнейшего использования в сельском хозяйстве, а фильтрат подвергают очистке от взвешенных частиц сепарированием с последующей его холодной стерилизацией через асбестоцеллюлозные пластины марки СФ, причем для мембран на основе ацетата целлюлозы (например, полимер4 Д ные пленки типа "Владипор" марки уАМ 100) перед сепарированием фильтрат культуральной жидкости доводят концентрированным раствором МаОН до рН

5,5-5, 7.

Фильтрат культуральной жидкости после предварительной обработки с содержанием сухих веществ 0,4-0,6%, ХПК 1300-1500 MrO /л подают на ультрафильтрацию через полупроницаемые мембраны, на 98-100% задерживаюшие молекулы фермента Руссулин, например мембраны марки YAM-100, Во избежание термической инактивации фермента температура фильтрата культуральной жид-. кости в процессе ультрафильтрации поддерживается равной 18-20оС.

Ультрафильтрацию проводят до содержания сухих веществ 4-67. Пои этом в ультрафильтрат проходит 95-987 всего объема фильтрата культуральной жидкости, 50-70% низкомолекулярных соедине-. ний и балластных белков, в результате чего удельная активность фермента возрастает в 2-3 раза.

Если начальное содержание фермента в грамме сухих веществ фильтрата культуральной жидкости 60-100 тыс. ед/г, ультраконцентрат доводят ледяной уксусной кислотой или концентрированным раствором едкого натра до рН 5,0-5,5 и подают на распылительную сушку с температурой на входе 120-130 С на выхоо

Э де 60-70 С, причем ультраконцентрат, полученный на ацетатцеллюлозных мембранах подается на сушку непосредственно после ультрафильтрации. После сушки получают мелкодисперсный, однородный порошок светло-коричневого цвета, 1 г которого растворяется в течение

10 мин в 100 мл воды при 35 С, что соответствует требованиям, предъявляемым сыродельной промышленностью к микробиальным заменителям сычужного фермента. Препарат станпартизуют поваренной солью до ИА !00 + 5 тыс. ед/r< а ультрафильтрат, имеющий ХПК 400

500 мгО /л и СВ 0,3-0,67., частично используют для приготовления исходной питательной среды или подают на биологическую очистку.

Если начальная удельная активность фильтрата культуральной жидкости составляет 30-60 тыс. ед/г, полученный ,ультраконцентрат диафильтруют водой с рН, равным рН ультраконцентрата, до удельной активности фермента 125130 тыс, ед/г. Диаконцентрат дополнительно ультрафильтруют до СВ 4-6%

883174

50 с последующим доведением рН до 5,05,5 и подачей на сушку или непосредственно подают на сушку после доведения рН, а диафильтрат и оба ультрафильтрата смешивают (ХПК смеси 350- S

450 мг Og/л, СВ 0,3-0,5X) и используют частично для приготовления исходной питательной среды или подают на биологическую очистку.

В таблице приведены данные по выходу промежуточных продуктов по стадиям получения ферментного препарата

Руссулин с применением методов осаждения и ультрафильтрации.

Как видно из таблицы, применение ультрафильтрации с последующей распылительной сушкой ультра- или диаконцентрата упрощает технологию получения ферментного препарата и существенно увеличивает его выход по 2В

MA.

Пример 1. Культура гриба

R1ssu1a deco1orans (штамм 2) выращи. вают на питательной среде, содержащей 7, кукурузная мука 1,8; гидролизные дрожжи 0,3; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,06; калий фосфорнокиспый двузамещенный 0,04; магний сернокислый 0 05; калий хлор..стый 0,1; натрий азотнокислый 0,2. 30 о

Ферментацию проводят при 25 С в течение 140 ч, избыточное давление

0,05 ИПа, подача стерильного воздуха в количестве 0 5 объема на один объем среды в минуту. Полученную культу- з о ральную жидкость охлаждают до 18-20 С и отделяют от нее мицелий гриба. Отделенную от культуральной жидкости биомассу сушат, а фильтрат доводят

30Х раствором NaOH до рН 5,7 и подают ао ,на сепарирование с последующим его высветлением и холодной стерилизацией через асбестоцеллюлозные пластины марки СФ. Выход фермента на стадии предваритею1ьной обработки культуральной жидкости 92Х.

310 л фильтрата культуральной жидкости с рН 5,7; СВ 0,57.; MA 360 ед/мп (удельная MA 72 тыс. ед/г), ХПК

1320 мгС /л подают на ультрафильтрацию через ацетатцеллюлозные мембраны с. эффективным диаметром пор 100 А.

В процессе ультрафильтрации температура фильтрата культуральной жидкости о поддерживается равной. 18-20 С. Ульт-. рафильтрацию проводят до 4,2Х СВ. При этом в ультрафильтрат проходит 95Х начального объема фильтрата культуральной жидкости, 587 низкомолекулярных веществ и балластных белков. В результате получают 15 5 л ультраконцентрата с MA 6480 ед/мп (удельная

MA 154 тыс. ед/г), рН 5,5. Выход фермента на стадии ультрафильтрации 90Х.

Ультраконцентрат подают непосредственно на распылительную сушку с температурой на входе 125 С, на выходе 65 С.

После сушки получают 573 г ферментного препарата с ИА 124 тыс. ед/г, 1 г которого в течение 10 мин растворяется о в 100 г воды при 35 С. Выход фермента на стадии сушки 705Х общий выход 58Х, выход ферментного препарата по весу в пересчете на стандартную активность

2,3 г/л культуральной жидкости. Дпя получения стандартной активности к полученному препарату в качестве наполнителя добавляют 110 г поваренной соли. Ультрафильтрат в количестве

294,5 л с содержанием сухих веществ

0,37 и ХПК 440 мгО /л направляют на биологическую очистку.

Пример 2. 80 л прошедшего предварительную обработку (выход фермента на стадии 92X) фильтрата культу" ральной жидкости Руссулина с рН 5,6;

СВ 0,6X; MA 250 ед/мп (удельная MA

42 тыс. ед/г), ХПК 1450 мг Од/л подают на ультрафильтрацию через ацетатцеллюлозные мембраны с эффективным о диаметром пор 105 А. В процессе ультрафильтрации температуру фипьтрата культуральной жидкости поддерживают о равной 18 — 20 С. Ультрафильтрацию проводят до 5,6Х СВ. При этом в ультрафильтрат проходит 967 начального объема фильтрата культуральной жидкости, 637 низкомолекулярных веществ и балластных белков. В результате получают

3,2 л ультраконцентрата с NA 5950 ед/мп (удельная ИА 106 тыс. ед/г), рН 5,5 и 76,8 л ультрафильтрата с CB 0,397

ХПК 420 мгО /л. Выход фермента на стадии ультрафильтрации 95Х. Ультраконцентрация 10 л воды, доведенной до рН

5,5, диафильтруют до содержания фермента в грамме сухих веществ

130 тыс. ед., при этом содержание сухих веществ в диаконцентрате снижается до 4,5Х. Выход фермента на ста- дии диафильтрации 98Х. Диафильтрат подают непосредственно на распыпительную сушку (получают 137 г препарата с MA 103 тыс, ед/г, выход фермента на стадии сушки 76X) или дополнительно ультрафильтруют до СВ 5,6Х. После дополнительной ультрафильтрации получают 2,5 л ультраконцентрата и О, 7 л

8831

Предварительная обработка пер ед в акуум-выпариванием (отделение мицелия гриба, сепарирование) 97-93 97-93

Предварительная обработка перед ультрафильтрацией (отделение мицелия гриба, сепарирование, осветление) 95-92 95-92

Вакуум-выпаривание фильтрата культуральной жидкости 90-80 87-74

Ультра- и диафильтрация фильтрата культуральной жидкости

96-88 91-81

Осаждение фермента этиловым спиртом, отделение осадка, экстрагирование фермента водой

70-60 61-44

Лиофильная сушка концентрата

80-70 49-31

Распылительная сушка концентрата

75-70 68-57

Стандартизация, фасовка и упаковка готового продукта 99-98 48-30 99-98 67-56

П р и м е ч а н и е: Данные по выходу промежуточных продуктов спиртоосажденного ферментного препарата взяты из опытно-промышленного регламента на производство ферментного препарата Ренниноруссулин

Г 10 К, M., 1979, ультрафильтрата 1 выход фермента на стадии дополнительной ультрафильтрации

987.7, Ультрафильтрат подают на распылительную сушку, в.результате которой получают 126 г ферментного препарата с MA 105 тыс, ед/г (выход фермента на стадии сушки 727), а диафильтрат и оба ультрафильтрата смешивают (ХПК. смеси 390 мг О> /л, СВ 0,387) и направляют на биологическую очистку. Общий l6 выход фермента 657 (с дополнительной

74 8 ультрафильтрацией 603), выход ферментного препарата по весу в пересчете на стандарную активность составляет

1,7 г/л культуральной жидкости.

Применение ультрафильтрации с последующей распыпительной сушкой ультраконцентрата в технологии получения молокосвертывающего ферментного препарата Руссулин позволит увеличить выход фермента и снизить затраты на его производство.

3174 10 тата целлюлозы рН ультрафильтрации устанавливают 5,5-5, 7.

2. Способ по п. 1, о т л и ч аю щ н и с я тем, что при содержании фермента в грамме сухих веществ фильтрата культуральной жидкости 30—

60 тыс. ед., полученный ультраконцентрат днафильтруют водой с рН, равным рН ультраконцентрата, до удельной ак10 тивности фермента 125-130 тыс. ед./г с последующей ультрафильтрацией диаконцентрата или его непосредственной подачей на сушку.

Источники информации, 15 принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР по заявке Ф 2794095/28-13, «л. С 12 М 9/50, 1979.

2. Авторское свидетельство СССР

20 Ф 522230, кл. С 12 0 13/IO, 1972 (прототип).

Формула изобретения

1. Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата Руссулин, предусматривающий культивирование его пррдуцента Russulа decolorans (штамм 2) на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые минеральные соли в условиях аэрации с последующим выделением целевого продукта иэ фильтрата культуралъной жидкости и его сушкой, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и увеличения выхода фермента, выделение ферментного препарата проводят путем ультрафипьтрации фильтрата культуральной жидкости до содержания сухих веществ

4-6Х с последующей распылитепьной сушкой ультраконцентрата при рН 5,05,5, причем для мембран на основе ацеТираж 531 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская нвб., д. 4/5

Заказ 10124/37

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Составитель И. Привалова

Редактор И. Николайчук Техред 3. фанта Корректор Г. Решетннк