8-(6-аминогексил)-аминоциклоаденозинмонофосфат- хлортриазинилцеллюлоза в качестве аффинного сорбента циклоаденозинмонофосфатзависимых белков

Авторы патента:

G01N33/56 - Исследование или анализ материалов особыми способами, не отнесенными к предыдущим группам

C07H19/20C12N11 - Соединения, содержащие гетероциклическое кольцо, имеющее один общий гетероатом с сахаридным радикалом; нуклеозиды; мононуклеотиды; их ангидропроизводные

ОПИСАНИЕ 886473

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВКДЕТЕДЬСТВУ (6! ) Дополнительное к авт. свид-ву (51)М. Кл.

С 07 Н 19/20

С 12 М 11/00

6 01 и 33/50 (22) Заявлено 06.12. 79 (21) 2890604/23-04 с присоединением заявки Рй (23) П фкудерсткнны6 кемнтет

СССР не аенеи нэобретеннй и открытий риоритет

Опубликовано 15. 12. 82. Бюллетень Р6 46 (53) УД 577. 15 (088. 8) Дата опубликования описания 17 . 12 .82

Ф.Ф. шаги-йукаметова;. Б.н. ууриненк1нт 0 саввам а к....,.,;.;,б (22) Авторы изобретения

Казанский ордена Трудового Красного ЗнаМЖМ" "-ЕЬ; :. " государственный университет им. В.И УлЯЦЩщцуфщ ина (21) Заявитель

1 (54) 8-(6-АМИНОГЕКСИЛ)-АМИНОЦИКЛОАДЕНОЗИНМОНОФОСФАТ-.ХЛОРТРИАЗИНИЛЦЕЛЛЮЛОЗА В КАЧЕСТВЕ АФФИННОГО СОРБЕНТА

ЦИКЛОАДЕНОЗИНМОНОФОСФАТЗАВИСИМЫХ БЕЛКОВ

Ж, 4к(сн,)

no вЂ” P

Изобретение относится к области .биохимии, в частности к новому химическому соединейию -8- (6-аминогексил)аминоциклоаденозинмонофосфат-хлортриазинилцеллюлозе

МН2

11 () ()Е, 0 где Й - остаток целлюлозы, которое является продуктом иммобилизации 8" (6-аминогексил) -аминоциклоаденозинмонофосфата на целлюлозе с помощью 2,4,6-трихлор-,5-триазина.

Данное соединение в силу своей то химической структуры обладает сродст вом к цикло-АМФ-зависимым белкам (на пример ферментам) и может .быть использовано в качестве- аффинного сорбента для выделения или очистки этих бел.ков путем аффинной хроматографии.

Известен-иммобилизованный íà сеферозе 8-(6-аминогексил)-аминоциклоаденозинмонофосфат, обладающий аналогичными свойствами и используемый в качестве аффинного сорбента при хроматографической очистке цикло-АМФ-зависимой протеинкиназы из семенников лосося (l) .

Синтез указанного аффинного сорбента основан на известной методике (2), и заключается в иммобилизации лиганда -8" (6-аминогексил) аминоциклоаденозинмонофосфата на матрице - активированной бромцианом сефарозе.

Содержание иммобилизованного аналога цикло-АМФ-60 м нуклеотида íà 1"г сухой сефарозы. Для хрЬматографии на данном сорбенте достигается 10-крат-, ная степень очистки фермента.

Однако данный аффинный .сорбент обладает рядом недостатков. °

886473

Вчастности,,был установлен факт относительно быстрого отщепления лиганда от матрицы (3). Скорость отщепления при рН 5 0, т.е. условиях, при которых преимущественно проводИт- s ся аффинная хроМатография цикло-АИФзависимых ферментов, составляет

-0,5 нм/ч.

Недостатком известного сорбента является также его низкая устойчивость, механическая прочность и невысокая степень очистки.

Целью изобретения является новый более стабильный и устойчивый аффинный сорбент, позволяющий достичь бо- 1 лее высокой кратности степени очистки.

Цель достигается свойствами нового соединения -8- (6-аминогексил)-аминоциклоаденозинмонофосфат-хлортриази- 20 нилцеллюлозы, используемого в качестве аффинного сорбента цикло-АИФ-зависимых белков.

Соединение получают по известному -.пособу (4) - иммобилизацией 8-(6-ами- и ногексил)-аминоцикло-АМФ на целлюлозе с помощью 2, 4,6-трихлор-Б-триазина.

Пример 1. Получение сорбента.

К i,5 г целлюлозы (Chemapol, ЧССР} Зо приливают 2 мл триэтиламина в 4 мп ацетона, через 10 мин к смеси добавляют 1 г 2,4,6-трихлор-g-триазина в .

20 мл холодного ацетона. Активирован-. ный таким образом носитель через з

30 мин промывают смесью ацетона и дис-. тилг ированной воды (1 :1), затем приливают 10 мл раствора 8-(6-аминогексил)-аминоцикло-АИФ (3500. спектрофотометрических единиц). Суспензию остав- щ ляют при перемешивании при,комнатной температуре на 16 ч, по истечении этого времени полученный препарат промывают 2 л смеси ацетона и дистиллированнои воды (1:1) и 0,5 л 0,1 И боратного буфера.

Количество иммобилизованного лиганда в полученных аффинных сорбентах определяют по содержанию Фосфора, что в пересчете составляет 3,2 моль нуклеотида на 1 r сорбента.

Пример. 2. Изучение взаимодействия.иммобилизованного на целлюлозе 8-(6-аминогексил)-аминоциклоАИФ с цикло-АИФ-.зависимым белком.

Для проверки взаимодействия с цикло-АИФ-зависимым белком к 0,5 r полученного аффинного сорбента приливают 1 мл исследуемого белка в концентрации от 1 до 10 оптических единиц (1-10 мг/мл по А о).

В качестве белкового препарата используют фракцию после очистки на гидроксилапатите при выделении протеинкиназы из мозга свиньи (5 . В за- висимости от исходной концентрации исследуемого блока с полученным сорбентом взаимодействует 71-923 белка соответственно.

Содержание иммобилизованного лиганда в полученном сорбенте остается постоянным как в процессе. хроматографии, так и при длительном хранении.

Хранение возможно в высушенном состоянии при комнатной температуре или при 4 С в виде суспензий, Сорбент обладает значительной механической прочностью, хорошей Фильтруемостью, что позволяет проводить многократную хроматографию под давлением без нарушений структуры препарата и использовать его в препаративных целях.

Достигаемая 15-кратная степень очистки.

Формула изобретения

8- (6-Аминогексил } аминоци клоаденозинмонофосфат-хлортриазинилцеллюлоза

Формулы Н2

ГС .0 в в

11 ООК

О где Я - остаток целлюлозы. в качестве аффинного сорбента циклоаденозинмонофосфатзависимых белков.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Jergil S., Guilford Н., Hosbach К. "Biospecific Affinity Chromatography of an Adenosine 3:5 - Cyciiс Monophosphate - Stimulated Protein Kinase (Protamine Kinase from

Trout Testis) by цз1п0 1плоЬ|lized

Adenine Йис1еойides", Biochem. J

v. 139, ; 2, 1974, 441-448.

2. Ахеп Р., Porath 3., Ernback S.

"Chemical Coupling of Peptides and

5 886473 б

Proteins to Polysaccarides by Means "FEBS Letters>, 1972, ч. 23, it.1, of Cyanogen Halides", "йайнге", 1967, 56-58.

v. 214, 1302-1304.. 4. "Иммобилизованные ферменты", под ред. Березина И.В., Антонова В,К,, 3. Tesser G.i. Fisch H.-И., Иартинека К.,И.,1976,èçä-воИГу,т.1,83 °

Schwyzer R. "Linitation of Affini ty 5. Nestегоva И., ЬазсЬепйо 1., Chronatography: Sepharose - Bound, Vasil iev V., Severin E. "Biochirn. Сус1!с 3,5 -Адепоз1ne Honophosphate", Вiophys Acta", 1975, 377, 271-281.

1 I

Корректор Е. Роако

Подписное

Составитель О. Скородумова

РевактоЕ П. Гооькова Техред Т.Иаточка

«ЪГЩФЮЮВ ФЮЪ ю ю ю ЪВЮЪФ4ЮЭфюююю»

Заказ 9532/31 Тираж 355

- ВНИИПИ Государственного комитета СССР по Делам изобретений и открытий

113035 Иосква Х-.35 Рачшская наб. а. 4/5 вЂ” -И вЂ”Эилиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4