Тушитель белковой флуоресценции

 

Союз Соввтсиик

Социалистическии

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (и) 894496 (6l ) Дополиительиое к авт. свид-ву (22)Заявлеио 050580 (21)2923582/18-25 с нрисоеяяиеиием заявки РЙ(23) Приоритет(Sl)M. Кд.

G 01 Н 21/734

9вудврвтвиивб квяктвт ссер ае лвлви язвбрвтвнн1. я вткрыткя

Опубликоваио 30.1281- Ьюллетеиь М48

Дата опубликоваиия описвиия 301 281 (») УДК 535.37 (088. 8) (72) Авторы

«зобретеив я

Э.E. Мхеян, А,Х. Машинян и С.Э. Акопов

Ереванский государственный медицинский институт (71} Заявитель (54) ТУШИТЕЛЬ БЕЛКОВОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Изобретение относится к биофизике, а именно к методам изучения белковой флуоресценции, и может быть применено для избирательного тушения флуоресценции ионами.

Известны следующие тушители белковоф флуоресценции: Сэ, МО к J,CuР

Ге +, РО. и др.(4 3.

Однако некоторые иэ них обладают способностью коагулировать белки (СцЯ+), другив (Fe++, NO ) — высокой 1о оптической плотностью в зонах возбуждения белковых хромофоров. 3 спосо-. бен вступать в реакцию с белками, P® обладает малой эффективностью тушения.

Все это может привести к искажению pe1j зультатов исследования и требует внесения поправочных коэффициентов.

Цель изобретения - получение неискаженных характеристик белковой флуоресценции.

Указанная цель достигается тем, что в качестве тушителя белковой флуоресценции применяют молибдат натрия.

В настоящее время молибдат натрия применяют в производстве лаков и красок, а также в химии для определения

Х- рв кулой среде анионов PQ, АэО, Si 0> в виде гетерополисоединений.

Новое назначение вещества основа" но на его способности тушить флуоресценцию белковых хромофоров.

Пример. Все растворы готовят на 10 мМ трис-НС1 буфере (рН-6,8).

Раствор молибдата натрия (1 мл в концентрации 1,5 мМ) непосредственно перед измерением смешивают с 3 мл раствора САЧ (сывороточный альбумин человека в концентрации 100 мкг/мл) или раствором триптофана (20 мкг/мл). Полученной смесью заполняют измерительную кювету с рабочей ранью в 1 см, которую помещают в рабочий отсек спектрофлуориметра. Монохроматор длины волны возбуждения устанавливают íà ве-. личину 280 нм (в случае САЧ и триптофана) или на 296 нм (где поглощает только триптофан). Регистрацию флуо894496

Формула изобретения ресценции проводят в интервале длин волн от 300 ао 350 нм, максимум Флуоресценции приходился на 332 и 344 нм при реГистрации спектров флуоресценции

САЧ и триптофана. При анализе экспери- 5 ментальных данных эффект внутреннего фильтра рассчитывается в тех случаях, когда оптическая плотность превышает

0,15 ед. Оптическая плотность определяется на спектрофотометре VSU-2P. Ни- 1В ке приведены параметры тушения флуоресценции САЧ и триптофана молибдатом и другими тушителями (нитрат натрия и йодид калия) в равных концентрациях (1,5 мМ). 15

Данные о концентрационной зависимости тушения флуоресценции триптофана в растворе ионами МоО представлены на фиг. 1 в Штерн-фольмеровских координатах: Ц -1 с - концентра"

«о 3О

3 ция тушителя («ю- интенсивность флуоресценции без тушителя 3 - интенсивность флуоресценции с тушителем). Как следует из фиг. 1, тушение флуорес- И ценции триптофана полностью соответствует закону Втерна-фольмера во всем использованном интервала. концентраций (от 0,5 мМ до 1 5 мМ) . Полученные величины констант тушения (К) показыва- 5Е ют,что молибдат обладает более высокой эффективностью тушения флуоресценции триптофана Ао сравнению с йодидом (для йодида к 6,25 М ", для молибдата К

11,2 М 3 . .Это .наглядно видно на фиг. 2, на которой представлены кривые тушения флуоресценции триптофана молибдатом,и йодидом (1-спектр флуоресценции триптофана без тушителя, 2 - спектр тушения йодидом,:3 - спектр 4в тушения молибдатом).

На фиг. 3 представлен спектр флуоресценции САЧ в отсутствии (4) и в присутствии 1,5 мМ молибдата натрия (5) °

Молибдат в отличие от йодида не способен вступать в реакцию с белками, Об этом свидетельствует тот факт, что молибдат не приводит к изменению формы спектров флуоресценции триптофана и САЧ и к смещению их максимумов. Молибдат в зонах возбуждения флуорвсценции белковых хромофоров не обладает такой высокой оптической плотностью, как нитрат и Fe +. так, если поглощение КО при алине волны 296 нм условно принять за 1004, то оптическая плотность Ma0@ состав% ляет 393. Это позволяет в случае применения молибдата не рассчитывать поправку на эффект внутреннего фильтра, так как оптическая плотность растворов триптофана и белка не превышает

0,15 ед. При добавлении NO требуется внесение поправки на эффект внутреннего фильтра.

Преимущество предлагаемого тушителя заключается в том, что он обладает вы- сокой эффективностью, не вступает в реакцию с белками, не требует внесения поправочных коэффициентов при длине олны 296 нм.

Применение молибдата натрия в качестве тушителя белковой флуоресцен" ции

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Бурштейн Э.А. "Биофизика", 1968, 13,. 3, 433.

894496

12,5

5 фив. У

Составитель Е. Карманова

Техред А Бабинецi Корректор А. Дзятко

Реда ктор Н. Безродная

Заказ 11472/68 Тираж 910

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.:.4/5

Подписное филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

ЯЖ УО УФ УИ МР ЧОО мМ фиа.2

36 ЗЮ М МУ ЖУ р фиаЗ