Способ получения биоспецифического адсорбента

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОГО АДСОРБЕНТА, включающий последовательную обработку полисахарида сначала медиатором, а затем ингибитором в присутствии бромциана, отличающийся тем, что, с целью повышения обменной емкости в отношении белка-фермента, полисахарид предварительно наносят на гранулы пористого стекла, в качестве медиатора берут декаметилендиамин, а в качестве ингибитора - L-аспарагиновую кислоту.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что нанесение полисахарида на гранулы пористого стекла осуществляют из водного раствора в вакууме. Изобретение относится к способам получения биоспецифического адсорбента и может быть использовано при выделении физиологически активных соединений, в частности L-аспарагиназы, из экстрактов Е. coli. Известен способ получения биоспецифического адсорбента на основе стеклянных шариков для выделения белков мембран плазмы. Для получения такого адсорбента поверхность стекла обрабатывают γ-аминопропилтриэтоксисиланом с последующей обработкой глутаровым диальдегидом и полизином. Все компоненты полученного данным способом биоспецифического адсорбента связаны ковалентно. Недостатки таких сорбентов заключаются в низкой удельной поверхности (0,8-2,0 м²/г) при размере частиц 50-100 мкм, малой концентрации группировок ингибитора, низкой воспроизводимости таких адсорбентов по активности, неспецифической адсорбции белков за счет ионных взаимодействий непосредственно с поверхностью стекла, что в некоторых случаях может привести к денатурации с потерей биологической активности. Наиболее близким к предложенному по технической сущности и достигаемому результату является способ получения биоспецифического адсорбента в виде шариков (зерен), пленок или волокон на основе полисахаридов, включающий обработку последнего медиатором и ингибитором в присутствии бромциана. Подобные адсорбенты позволяют резко повысить скорость фильтрования в ходе выделения ферментов и отмывки. Недостатком известного способа является то, что взаимодействие белка фермента возможно только с поверхности зерна или пленки, что резко снижает обменную емкость полученных адсорбентов. Целью изобретения является повышение обменной емкости полученного адсорбента в отношении белка-фермента. Поставленная цель достигается предложенным способом получения биоспецифического адсорбента, включающим нанесение на гранулы из пористого стекла полисахарида из водного раствора в вакууме и последовательную обработку полисахарида сначала медиатором декаметилендиамином, а затем ингибитором L-аспарагиновой кислотой в присутствии бромциана. Отличие предложенного способа заключается в том, что полисахарид предварительно наносят на гранулы пористого стекла, в качестве медиатора берут декаметилендиамин, в качестве ингибитора L-аспарагиновую кислоту. Другое отличие состоит в том, что нанесение полисахарида осуществляют из водного раствора в вакууме. Способ осуществляют следующим образом. Гранулы микропористого стекла суспендируют в водном растворе полисахарида с последующей их сушкой в вакууме и обработкой в водно-органическом растворе бромцианом при рН 10-12 с отмывкой буферным раствором с рН 9,0-9,5. Затем проводят обработку гранул с подшитым слоем полисахарида водным раствором декаметилендиамина и раствором α-метилового эфира Nα-трифторацетил-L-аспарагиновой кислоты в присутствии карбодиимида. После чего гранулы отделяют, обрабатывают слабым раствором щелочи и водой. Содержание иммобилизованного ингибитора определяли гидролизом адсорбента 6н. раствором соляной кислоты при 110^оС в течение 16 ч с последующим аминокислотным анализом гидролизата. Содержание полисахарида определяли гидролизом 72%-ным водным раствором серной кислоты при последующей цветной реакции с антроном. П р и м е р 1. 20 мл пористого стекла смешивают с 50 мл 10%-ного водного раствора полисахарида декстрана и суспензию тщательно перемешивают при пониженном давлении для удаления пузырьков воздуха из пор. Затем суспензию переносят на стеклянный фильтр и отделяют от избытка раствора полисахарида, одновременно слегка подсушивают его просасыванием воздуха. Обработанный полисахаридом носитель высушивают в вакууме при нагревании на водяной бане (50^оС) до постоянного веса. Полученный полисахаридно-силикатный носитель обрабатывают бромцианом (4 г) в водно-ацетоновой смеси (40% ацетона), добавляя при этом 2 М NaOH для сохранения рН 10 в течение 20 мин. Затем полученный носитель отмывают от избытка бромциана ацетоном и 0,1 М натрий-карбонатным буфером (рН 9,5). Полученный активированный носитель смешивают с 40 мл 0,1 М раствора декаметилендиамина в воде (рН 9,5) и перемешивают в течение 10-15 ч при 4^оС. Затем отмывают от непрореагировавшего декаметилендиамина водой и модифицированный носитель смешивают с 40 мл 20%-ного раствора Nα-трифторацетил-α-метилового эфира L-аспарагиновой кислоты в диметилформамиде. рН суспензии доводят до 4,5 с 0,05 н. едким натром. При перемешивании добавляют 40 мл 40% -ного раствора 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, рН суспензии поддерживают добавлением 1 н. раствора соляной кислоты в течение 2 ч, полученный адсорбент отмывают водой и диметилформамидом, а затем для определения трифторацетильной и метоксильной защитных групп суспензию перемешивают с 200 мл 0,2 н. раствора едкого натра, отмывают водой и хранят при 4^оС. Содержание иммобилизованного ингибитора 8,4 х 10^-4 М. Содержание полисахарида 9,2 мг/г адсорбента. П р и м е р 2. 20 мл пористого стекла смешивают с 50 мл 15,0%-ного водного раствора декстрана и суспензию тщательно перемешивают при пониженном давлении для удаления пузырьков воздуха из пор. Затем суспензию переносят на стеклянный фильтр и отделяют от избытка раствора полисахарида, одновременно слегка подсушивая его просасыванием воздуха. Обработанный полисахаридом силикат высушивают в вакууме при нагревании на водяной бане (60^оС) до постоянного веса. Полученный полисахаридно-силикатный носитель обрабатывают бромцианом (6 г) в водно-ацетоновой смеси (60% ацетона), добавляя при этом 3 н. едкий натр для поддержания рН 11 в течение 30 мин. Затем полученный носитель отмывают от избытка бромциана ацетоном и 0,2 М натрий-карбонатным буфером (рН 9,0). Полученный активированный носитель смешивают с 60 мл 0,2 М раствора декаметилендиамина в воде (рН 9,3) и перемешивают в течение 10-15 ч при 6^оС. Затем отмывают от непрореагировавшего декаметилендиамина водой и модифицированный носитель смешивают с 60 мл 10%-ного раствора Nα-трифторацетил- α-метилового эфира L-аспарагиновой кислоты в диметилформамиде. рН суспензии доводят до 5,0 добавлением 0,1 н. едкого натра. При перемешивании добавляют 60 мл 30%-ного раствора 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида в дистилированной воде, рН суспензии поддерживают добавлением 2 н. раствора соляной кислоты в течение 3 ч. Полученный адсорбент отмывают диметилформамидом и водой, а затем для отщепления активных групп суспензию перемешивают с 150 мл 0,1 н. раствора едкого натра, отмывают водой и хранят при 4^оС. Содержание иммобилизованного ингибитора 1, 0,2х10^-2 М. Содержание полисахарида 13,2 мг/г адсорбента. Использование биоадсорбента для выделения L-аспарагиназы на E.coli осуществляют следующим образом. 5 мл экстракта клеток E.coli (удельная активность 30 ME/мл) пропускают через колонку с биоадсорбентом (1 х 18 см) в которой находится 18 мл адсорбента, полученного описанным способом. Колонку последовательно промывают 100 мл 0,05 М натрий-боратного буфера (рН 7,3-8,0) и 100 мл 0,5 М KCl в том же буфере. L-Аспарагиназу элюируют 0,02-0,04 М раствором L-аспарагина вы том же буфере, содержащем 0,5 М KCl. Регенерацию адсорбента осуществляют промывкой 2 М раствором хлорида калия, а затем исходным буферным раствором. Результаты испытаний представлены в таблице. Как следует из представленных данных, удельная активность адсорбента, полученного по предложенному способу, составляет 240-310 МЕ/мг, тогда как у адсорбентов, полученных по известным способам, она не превышает 220-250 МЕ/мг. Кроме того, полученный адсорбент стабилен и может использоваться многократно, по крайней мере 10-11 раз.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОГО АДСОРБЕНТА, включающий последовательную обработку полисахарида сначала медиатором, а затем ингибитором в присутствии бромциана, отличающийся тем, что, с целью повышения обменной емкости в отношении белка-фермента, полисахарид предварительно наносят на гранулы пористого стекла, в качестве медиатора берут декаметилендиамин, а в качестве ингибитора - L-аспарагиновую кислоту. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что нанесение полисахарида на гранулы пористого стекла осуществляют из водного раствора в вакууме.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 36-2000

Извещение опубликовано: 27.12.2000        

---