Способ определения фертильности пыльцы цветковых растений

 

Союз Советских

Социалистических

Республик, 1906456 р

1 (Sl ) Дополнительное и авт. свид-ву

I (51)М. Кл. (22)Заявлено 13,10.80 (2) ) 2993512/30-15 с присоединением за:;-:и №вЂ” (2З) Приоритет

О луб :::"--"-ов но 2 3.02. 82, Бюллетень № 7

Дата о;.:ублнкования описания 23.02.82

А 01 Н 1/02

//А 01 6 7/00 (овудзрлщииьй квинтет

Gf СР да делам вм4ре,оиню и Отирьпнй (53) УДК831 52:

:581:6 (088.8) (72,1 ABTQp изобретения

Н. В. Смирнова-Гараева (71 ) Заявитель

Кишиневский сельскохозяйственный институт

{54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРТИЛЬНОСТИ ПЫЛЬЦЫ

LIBETKOBblX РАСТЕНИЙ

Изобретение относится к селекции и семеноводству и может быть использовано в сельском хозяйстве.

Известны способы определения фертильности, предусматривающие проращивание -. пыльцы в камере Ван-Тигена с использо5 ванием искусственной среды или использование способа B.Ñ. 11 .ардакова путем воздействия бензидила на живую пыльцу, содержащую пероксидазу 1) . о

Однако известные определения фертильности пыльцы не позволяют проводить анализ в полевых условиях из-за необходк юсти использования специального обо15 рудования, а также требуют значительных затрат времени, что отрицательно сказывается на качестве пыльцы и искажает получаемые результаты.

Известен также способ определения жиз20 неспособности и фертильности пыльцы

П.И. Днако, заключающийся в том, что о жизнеспособности пыльцы судят по наличию активного дыхательного фермента сукциндегидразы, в присутствии которого бесцветный раствор 2, 3, 5 — трифенилтетразол хлористый в l/15 М фосфатном буфере Сере нсена с рН 7, 1 7 восстанавливается в формазан ярко-красного цвета.

Погибшие пыльцевые клетки остаются бесцветными (2> .

Недостатком известного способа является то, что степень окраски пыльцевых зерен в красный цвет осуществляется визуально, что не позволяет различить категории полустерильных и полуфертильных пыльцевых зерен, кроме того, дыхатель ный фермент сукциндегидраза, дающий ярко-красное окрашивание, выделяется из пыльцевого зерна в окружающую среду, что дает ярко-красное окрашивание этого раствора, маскирующего истинный цвет пыльцевых зерен.

Цель изобретения — получение более точных результатов за счет быстрой и длительно сохраняемой фиксации.

Поставленная цель достигается тем, что в смесь 0,5-1,0 Ъ-ного раствора

906456 з

2, 3, 5-трифенилтетразода хлористого и 1/1 5 М фосфатного буфета Серенсена,x рН 7,17 вводят 1,0-1,3% Hûé раствор йод-калий-йод, полученную массу микроскопируют и по окраске пыльцы судят об ее фертильности.

1-3%ный раствор йод-калий-йод готовят из расчета 1-3 г металлического йода в растворе 2 r калий-йод и 297 г дистиллированной воды (по Грамму). К фертидьным пальцевым зернам относят зерна черно-фиолетовой окраски, к полуфертильным — зерна, одна клетка которых черно-фиолетовой окраски, а другаярозово-оранжевой, к полустерильнымзерна с серо-фиолетовой окраской и к стериальным — зерна белые или яркожелтые.

Собранную в поле пыльцу наносят тон20 кой кисточкой на предметное стекло и распределяют тонким слоем на плошади в 1 см, капают на пыльцу 1 каплю 0,51,0/-ного раствора 2, 3, 5-трифенилтетразола хлористого в 1 /1 5 М фосфатном буфере Серенсена, рН 7,17, тщательно смешивают Io получения однородной массы, которая сразу розовеет от выделяющегося фермента сукциндегицразы. Затем слегка смоченной в 1,0-3,0 / -ном растворе З0 йод-калий-йода стеклянной палочкой еще раз тщательно перемешивают массу пыльцы, которая в результате приобретает темную окраску ll хорошо различима в розовой IKHIIKDc TtI, Для микроскопирования с помощью мик35 роскопа МБС 1 или МБС-2 в поле или в помещении полученную смесь пыльцы и реактивов покрывают покровным стеклом с нанесенной заранее сеткой. Размер сетки 10х1 0 мм, причем при подсчете фертильных и стерильных пылинок просматривают 5 вертикальных рядов сетки, считая через ряд (10 ячеек х рядов = 50 ячеек-квадратов) .

Под влиянием использования в реакции двух перечисленных реактивов пыль цевые зерна и окружающий раствор сначала становятся розовыми, затем оранжевыми, потом фертильные зерна приобретают черно-фиолетовый цвет (от взаимо действия йода и крахмала), а светлая половина фертильных пыльцевых зерен становится оранжевой или абрикосов розовой.

Весь IIpc)IIQcc анализа пыльцы от мо мента ее взятия цо окончания микроскопиро",ания занимает 5-10 мин.

При необходимости вывоза пыльцы с поля цня анализа в паборатории данный способ обеспечивает фиксирование за счет йод-калий-йода истинного количества фертильных пыпьцевых зерен. Окраска, вызва иная последовательным действием реактивов, обеспечивает устойчивый цвет, сохраняющийся на протяжении не менее шести месяцев без изменения. При длительном хранении окрашенной пыпьцы, ее следует поместить на предметное стекло с выемкой дпя "висячей каппи, обработать реактивами согпасно данному способу, покрыть покровным стекпом и хра нить даже в высохшем состоянйи Приступая к подсчету процента фертильных пыльцевых зерен, необходимо добавить к пыльце одну каплю цистилдированной или кипяченой воды. Подсчет производится на покрывном стекле по указанной методике.

Пример 1. Обработку производят следующим образом: пыльцу кукурузы генотипов wF -9 и Д-765 наносят тонким слоем на предметное стекло кисточкой на плошади 0.5 см. Затем капельнтьцей наносят одну каплю 0,5 /о-ного раствора

2, 3, 5-трифенилтетразола хлористого в 1/1 5 M фосфатном буфере Серенсена, рН 7,17 и препаровальной иглой тшатель. но смешивают с пыльцой. B течение

3 мин проходит реакция в данной смеси, и поц влиянием дыхательного фермента пыльцы ее живые клетки и окружающий раствор окрасились в розовый цвет одной интенсивности. Затем стеклянную палочку окунают в 1,0" -ный раствор йод-калиййода, стряхивают каплю в торону и мок рую палочку вводят в смесь пыпьцы и описанного раствора, тщательно перемешав смесь. В результате раствор в смеси приобретает абрикосово-оранжевый цвет, 8 пыльцевые зерна потемнеют, что видно невооруженным глазом. Под стереоскопическим микроскопом МБС-2 видно, что жидкость в капле смеси имеет абрикосово-оранжевую окраску, а пыльцевые зерна, отреагировав с йодом, получа ют разную окраску в зависимости от степени фертильности, а именно: фертильные зерна становятся черно-фиолетовыми, полуфертильные имеют половину (одну клет ку пыльцевого зерна) черно-фиолетовую, а вторую половину (вторую клетку пыль девого зерна) розов -оранжевую, полусте рипьные пыльцевые зерна равномерно или однобоко серо-фиолетовые или серо-корич неватые, стерипьн1не — белые или яркоСоставитель N. Дранишников

Тех ед Л. Пекарь

Кор екто Е. Рошко

Редакто С. Пат ушева

Тираж 698 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб. д. 4/5

Заказ 431/3

Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 9О64 жолт е в зависимости от отсутствия ипн наличия органических пел аста. При помаши сеточки «а покровном стекле подач тывают процент фертильности пыльцы.

Весь процесс обработки пробы пыльцы занял 5 мин и проверялся десятикратно на свежесобранной пыльце. Проверка показала, что после описанной обработки пыльца не изменяла окраски в течение более полугода. Это дает возможность долгое время подсчитывать процент фертильных и стерильных зерен в процессе их хранения в закрытой склянке в холодильнике при температуре +2а С.

Пример 2. Берут 0,75 /-ный раствор 2, 3, 5-трифенилтетразола хлористого и 2,0%-ный раствор йод-кали. :.--йод, Последовательность обработки пыльцы была та усе. На предметное стекло на плошадь 0,5 см -наносят тонкий слой пыльцы. Сверху наносят одну каплю 0,75 1ного трифенилтетразола хлористого в

1/15 N фосфатном буфере Серенсена, рН

7,17, тшательно перемешивают. Возникла интенсивно розовая окраска пыльцы и раствора. Через 2 мин вводят в смесь стеклянную палочку, смоченную 2,0%-ным йод-калий-йод, тшательно перемешали.

Немедленно возникла дифференцированная окраска — раствор стал розово-оранжевым ЗО а пыльцевые зерна от черных до розоватооранжевых и белых. Под микроскопом при увеличении объектива х 4., окуляра х 7, с помошью сеточки, нанесенной тушью на цокровное стекло, проводят подсчет ко. ичества черно-фиолетовых фертильных, наполовину фиолетовых наполовину оранжевых полуфертильных, белых или желтых стерильных . пыльцевых зерен.

Подсчет проводят по 50 ячеям-квадратам сеточки на стекле. Данный пример показал, что дифференцированная окраска пыльцы сохранялась более полугода.

Пример 3. В данном случае используют 1,0%-ный раствор 2, 3, 5-трифенилтетразола хлористого в 1 /1 5 N фооJ фатном буфере Серенсена, рН 7,17 и

3,0%-ный раствор йод-калий-йод .Свежесобранную пыльцу наносят кисточкой на

5(6 предмет«ое -текл., сгерху капают 1,0-", ный раствор трифе«нлтетразола, размешивают пречароваль«ой иглой н тут же вводят стеклин«ую палочку, смоченную 3,0%ным йоп-калий-йод, перемешивают смесь.

Немедленно воз«икает инте«сдвная окраске растворе от 1али«овс-розового до розово-ор; íæåâîãî цвета и темная чернофиолетовая, серая н белая окраска пыльцевых зерен, заметных невооруженным глазом, Предметное стекло пр крывают цокров«ым с нанесенной на него тушью сеточкой. Приготовленный препарат транспортируется в лабораторию и затем микроскопируется, как в примерах 1 и 2.

Дифференцированная окраска пыльцевых зерен сохраняется B течение полугода.

Проверка показала, что по известному способу (Диакону) при увеличении срока хранения процент фертильности пыльцы понижается. Так, например, через 2 ч после сброса пыльцы ее фертильность

70,1%, через 6 ч 59,2%, через 14- ч

43,2%, что явняется результатом гибели пыльцы от высыхания.

Формула изобретения

Способ определения фертильности пыльцы цветковых растений путем воздейс вия на нее 0,5-1,0%ным раствором "2, 3, 5-трифенилтетрезола хлористого в

1/15 M фосфатном буфере Серенсена, рН 7,17, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью получения более точных результатов за счет быстрой и длительно сохраняемой фиксации, в полученную смесь вводят 1,3-3,0%-ный раствор йод-калиййод, после чего полученную массу микроскопируют и о окраске пыльцевых зерен судят об их фертильности.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Паушева 3. П. Практикум по цитологии растений. N., Колос, 1974, с. 215-224.

2. Там же, с. 219 (прототип).