Способ определения гормона роста в плазме крови

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

О П И с А Н И Е 907437

ИЗОБРЕТЕН Ия

1 ,/б==-; г ,б

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22)Заявлено 08. 07.80 (21) 2954592/30-15 (5l )lVL. К,п. с присоединением заявки РЙ

G 01 N 33/74

Гооудерстеенный комитет

СССР (23) Приоритет до делам изобретений и открытий

Опубликовано 23. 02. 82. Бюллетень % 7

Дата опубликования описания 25. 02. 82

{5З) ЙК616. 154. . 43(088. 8) (72) Автор изобретения

В. Ф. Сухих

О

1 :.: .„.„„,„

Всесоюзный научно-исследовательский нститу1 фйЖЫ8гии, биохимии и питания сельскохозяйственныхИЖЛеемивне!

«

: Ф)(7! ) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОРМОНА РОСТА В ПЛАЗМЕ КРОВИ

Изобретение относится к биологической промышленности и биологической химии, в частности к индикаторно-иммунологическим способам определения белковых гормонов в крови, экстрактах гипофиза или в другом. биологическом материале, получаемом при выделении гормонов.

Наиболее близким к предлагаемому способу определения гормонов роста является способ, основанный на приме-1 нении высокоактивного фермента (пероксидаза из хрена в качестве индикатора. В указанном спосбе, предусматривается проведение работы в две ста, I 5 дии: инкубирование исследуемой плазмь, с антителами и гормоном-индикатором в течение 48 ч и выделение комплекса гормона с антителом на иммуносорбенте в который включены антитела проУ

20 тив глобулинов кролика. Антисыворотку получают подкожной инъекцией 8 мг гормона один раз в неделю в течение месяца. В качестве сорбента исполь2 зуют агар, сефарозу или сефадекс.

Общее время, необходимое для проведения анализа, составляет 49 ч. Схема проведения анализа следующая: к

0,1 мл исследуемой сыворотки крови прибавляют 0,5 мл антисыворотки к гормону; пробы перемешивают и инкубируют 24 ч. Затем добавляют 0,1 мл меченого ферментом гормона,.перемешивают и вновь инкубируют 24 ч при

4оС, после чего прибавляют 150 мкг нерастворимых антител в виде агарового иммуносорбента и инкубируют

90 мин при постоянном помешивании.

Общий объем инкубационной среды составляет 1000 мкг. Иммуносорбент промывает 4 раза 0,851 ным раствором хлористого натрия и в иммуносорбенте определяют активность фермента.

Концентрацию определяемого гормона находят по калибровочной кривой.

Чувствительность этого способа не выше, чем при использовании им3 907437 портных радиоиммунологических наборов - 0,5 нг в пробе, или 5 нг/мл (1

Недостатком его является то, что анализ длится очень долго, результат можно получить только через двое сут.

Цель изобретения - ускорение способа определения гормона роста в плазме крови.

Поставленная цель достигается тем, что в способе определения гормона 1в роста в плазме крови, включающем ее смешивание с антителами к гормону, инкубацию полученной смеси, добавление меченого ферментом гормона, инкубацию, прибавление иммуносорбента и выдерживание, промывание иммуносорбента 0,853-ным раствором NaCl и последующее установление активности фермента на иммуносорбенте, для смешивания берут 20 мкл плазмы крови и 10-12 нг антител в объеме 90100 мкл,добавление меченого ферментом гормона проводят путем прибавления 9-10 нг гормона-индикатора в объеме 20 мкл, а инкубацию проводят

2 5-3 ч.

Предлагаемый способ может быть выполнен следующим образом: к 20 мкл исследуемой биологической жидкости, например плазмы крови, прибавляли

12 нг кроличьх антител в виде иммуносорбента в объеме 10 мкл. Затем в каждую из пробирок вносили по 10 нг гормона-индикатора в объеме 20 мкл.

Пробирки инкубировали 3 ч при 37 С, затем иммуносорбент промывали три раза 0,853-ным раствором хлористого натрия при рН 7,0-7,2. Непосредственно в иммуносорбенте определяли пероксидазную активность путем прибавления к суспензии иммуносорбента

1,5 мл реактива, забуференного фосфатами до рН 6,0 и содержащего 2,5х10 В

-Э . перекиси водорода и 7х10 . ортодианизидина. Пероксидазную активность выражали в процентах к активности фермента в нулевой пробе, не содержащей ни стандартный, ни определяемый гормон. Концентрацию определяемого гормона находили по калибровочной кривой Калибровочную кривую строили с разведениями стандартного гормона в интервале от 0,1 до 2,0 нг/мл. Для приготовления стандартных разведений гормона роста, для разбавления меченого гормона использовали забуференный фосфатами до рН 7,4 0,15 — молярный раствор хлористого натрия, содержащий компонент, препятствующий адсорбции гормона на иммуносорбенте и стенках пробирки (1 альбумина из сыворотки человека или 0,05 тритона

Х-100). В качестве индикатора применяли пероксидазу из хрена, которую ковалентно конъюгировали с гормоном роста, используя для этой цели либо бифункциональные особенности глютарового альдегида либо окисляя углеводные остатки пероксидазы периодатом натрия до образования активных альдегидных групп.

ЭО

Э5

Пример 1. Анализ гормона роста проводят следующим образом: к 20 мкл исследуемой биологической жидкости (например, плазмы крови) .прибавляют 10-12 нг кроличьих антител в объеме 98- 100 мкл; антитела должны быть иммобилизованы на сорбенте (например, по способу Кузовлевой:

Кузовлева О. Б.), Выделение индивидуальных белков проводят при помощи новых иммуносорбентов, способных присоединить большие количества антигена. Затем

IB каждую из пробирок по 9-10 нг гормона-индикатора в объеме 20 мкл.

Пробирки инкубируют 2,5-3,0 ч при

37 С, после чего иммуносорбент промывают, удаляя таким образом не связавшийся гормон-индикатор. В иммуносорбенте определяют пероксидазную активность, которую выражают в процентах к активности фермента в пробе, в которую не вносили ни стандарт- Эо ный, ни определяемый гормон. Концентрацию определяемого гормона находят по калибровочной кривой, построенной с несколькими разведениями стандартного гормона (от 0,1 до

2, 0 нг/мл) .

Пример 2. B работе использовали очищенный препарат гормона рос4 та. Однако очистка в соответствии с требованиями для радиоиммунного стан дарта в данном способе не требуется.

Антисыворотку получали путем однократной внутрикожной инъекции гормонального препарата животному (например, кролику), либо методом многократных подкожных инъекций микродоз (0,4-0,5 мг) очищенного гормона. !

При определении концентрации гормона в плазме крови этим способом и способом, взятым в качестве извест5 907437 ного, получены близкие значения абсолютных величин: 22,3 1,3 и 22 1 нг/мл соот ветст венно.

Концентрация гормона роста в плазме крови, нг/мл

Номер животного

Предлагаемый способ

Известный способ

Разница н г/мл

7944

28,0

3,6

+1,0

7936

17,8

-2,2

11,0

0582

19,8

-0,2

1,0

26,0

7910

+2,0

7,7

28, 4.

+1,4

7929

5,2

20,8 7992

-0,2

0 9

19,8

7955

-1,2

5,7

7978

28,0

3,6

+1,0

3741

17,8

6,3

-1,2

20,8

3798

-0,2

0,0

17,8

3745

-0,2

М + м = 22,3 + 1,3

Р О,5

22+1 формула изобретения

Способ определения гормона роста в плазме крови, включающий ее смеши50 вание с антителами к гормону, инкубацию полученной смеси, добавление меченного ферментом гормона, инкубацию, прибавление иммуносорбента и выдерживание промывания иммуносорбенss та 0,85 -ным раствором NaC1 и последующее установление активности фермента на иммуносорбенте, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью

Затраты .времени на определение гормона в серии образцов (40-50 проб} в предлагаемом способе составляют приблизительно 5 ч, в том числе на, инкубацию 3 ч, в известном - 50-52ч, из них на проведение инкубации- 49ч.

Указанный способ определения гормона роста апробиргван в практике ра. боты Всесоюзного научно-исследовательского института физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных для определения гормона роста в крови молодняка крупного рогатого скота (как у нормальных животных, так и в различных физиологических опытах) и при очистке гормональных препаратов. Чувствительность способа, определенная по калибровочной кривой со стандартным препаратом гормона роста, составляет 0,1 нг/мл, точность (по ряду параллельных образцов) — 884. По этим критериям предлагаемый способ предпочтительнее радиоиммунологического

Сравнение предлагаемого способа определения гормона роста с известным метода и способа, взятого в качестве известного.

Способ может быть использован в биологической промышленности при производстве гормональных препаратов, так как во всех процессах,связанных с выделением и очисткой гормонов, предусмотрен многократный контроль активности промежуточных продуктов и основного препарата.

907437

Составитель A. Макаров

Редактор A. Шандор Техред Е. Харитончик Корректор И "ожо

Заказ 581/52 Тираж 883 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва Ж-)5 Раушская наб. .в. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ускорения способа определения, для смешивания берут 20 мкл плазмы крови и 10-12 нг антител в объеме 90100 мкл, добавление меченого Фермен" то гормона проводят путем прибавления 9-10 нг гормона-индикатора в объеме 20 мкл, а инкубацию проводят

2,5-3,0 ч.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Ефсик В. Ф. Ферментно-иммунологический метод определения белковых гормонов в крови и биологических жидкостях.-"Проблемы эндокринологии". 1977 т 23, Ю 6, с. 82-85.