Способ определения осмотической резистентности лейкоцитов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскик

Соцмалнстмческнк

Веспублик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 070580 (21) 2938624/30-15 ($$) М. Кд.з с присоединением заявки № (23) Приоритет

G N 33/96

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий

ИЗ1 УДК 612..112 (088.8) Опубликовано 28.0282. Бюллетень ¹ 8

Дата опубликования описания 17.03.82 (72) Авторы изобретения

В.В.Демьяненко и С.М.Демьяненко чч .Е, ч,„.,, 1 (71) 3а яв итель

Мордовский государственный унинерсите им. Н.П.Огарева (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСМОТИЧЕСКОЙ

РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в клиниколабораторных гематологических исследованиях.

Известен способ изучения осмотической резистентности лейкоцитов, заключающийся н инкубации изолиронанных лейкоцитов в гипоосмолярной среде, содержащей краситель, с последующим подсчетом неразрушенных клеток в счетных камерах flj.

Недостатком указанного способа является качестненный характер реакции, длительность анализа (свыше

3 ч), значительная трудоемкость (подсчет клеток осуществляется пятикратно н течение 3 ч).

Известен также способ количественной регистрации реакции аллергического лейкоцитолиэа, заключающий" ся в антоматической регистрации изменений суммарного электрического сопротинления взвеси изолированных лейкоцитов при инкубации их с аллергеном (2).

Недостатком известного способа является применимость его.лишь для регистрации реакции специфического аллергического лейкоцитолиэа беэ учета уровня неспецифической реэистентности лейкоцитов к гипоосмотическому фактору.

Цель изобретения — повышение эффективности и точности определения. указанная цель достигается тем, что в способе определения осмотической резистентности лейкоцитов, включающем измерение суммарного электрического сопротивления лейкоцитарной взвеси в инкубационной среде, в качестве инкубационной среды используют гипоосмолярную смесь, состоящую из 50 мл 1,3 ° 10

5 ° 10 " И буферного раствора с рН 6,6

8,0, лейкоцитарную. взвесь вносят в количестве 100, — 250 мкл, после чего полученную среду вносят в конт20 рольную и опытную кюветы кондукто-, метрической установки, затем в конт рольную кювету добавляют 0 15.0,05 мл ингибитора протеолиэа и измеряют изменение суммарного электрического сопротивления лейкоцитарной взвеси в опытной кювете по отношению к контрольной.

В качестве ингибитора протеолиза испопьэуют контрикал или траэилол н дозе 1000-6000 Ед.

909635

RI = kg (2) Содержание лейкоцитов в 1 мкл

Коэффициент )с

2000

2,60

2,08

2500

3000

1,73

3500

1 49

4000

1,30

На фиг. 1 изображена осмотическая лейкограмма при граничных значениях ,параметров способа; на Фиг. 2— .то же, по средним значениям парамет;ров способа.

Пример 1. Приготовление 5 инкубационной смеси. В пробирку, содержащую 5,0 мл 1,25 ° 10 М трислимонного буфера, вносят 200 мкл лейковэвеси в аутоплазме. Полученную инкубационную смесь по 2,25 мл вно- 10 сят в контрольную и опытную кюветы кондуктометрической установки. Реакция в контрольной пробирке ингибируется добавлением 0,05 мл контрикала. При 37 С реакция продолжается 35

45 мин (табл. 1).

Обработка графичеСкой записи заключается в количественной оценке интенсивности осмотического лиэиса лейкоцитов по Формуле 20

В t. C4, где И вЂ” отклонение пера самопишущего милливольтметра, мм; t — время реакции, мин;Ч вЂ” объем взвеси лей коцитов s аутоплазме, равный 200 мклу

q - коэффициент разведения лейко-;:: взвеси, равный 26; С - содержание лейкоцитов в 1 мкл лейковэвеси; Rg-, показатель интенсивности гипоосмо- N лярного лейколизиса в условных един ицах.

Поскольку значения V и о являются постоянными величинами, то выражение - Ы - представляют в виде козф- 35 фициента, значения которого иэменяютeq ся в зависимости от содержания лей. коцитов в 1 мкл лейковэвеси (С ), а выражение,(1) представляют в виде формулы 40

Значения коэффициента k в зависимости от уровня лейкоцитов в 1 мкл лейковзвеси (С) представлены в ( табл. 1.

О скорости ливиса лейкоцитов в гипоосмолярно11 среде, т.е, о характере их осмотической резистентности, i 0 судят также по осмотическим лейкограммам (фиг. 1 и 2), где по оси ординат откладывают процент разрушенных клеток, а по оси абсцисс . время изменения реакции в минутах..

Для этого определяют процент сдвига писчика за равные интервалы времейи .(О -9, 9 -18, 18" -27, 27 -36

36 -45 j, принимая максимальное отклонение писчика 13<,q за 100 Ъ.

Пример 2. Концентрацию буфер -60 .. ного раствора для работы с серийной кондуктометрической установкой, например Фермент-1, определяют требованием к соблюдению минимальноГо фона, т. е. обеспечением минй мального вклада концентрации носителей электрических зарядов буферного раствора в суммарную электропроводность инкубационной смеси в ходе реакции субстрат — фермент. Оптимальные значения концентраций буферных растворов для указанных целей находятся в пределах 10 —

5,10 М.

Концентрация субстрата при кондуктометрических исследованиях лежиТ в диапазоне 10 - 10 М. Опытным путем нами установлено, что кинетическая кривая реакции гипоосмолярного лей-. колизиса сохраняет линейный характер при объеме лейкоцитарной взвеси от

60 мкл до 300 мкл, однако при объеме лейковзвеси 60 - 100 мкл угол наклона кривой слишком мал.

Наилучшие результаты реакции гипоосмолярного лейколизиса достигают при объеме лейковзвеси 150

250 мкл (табл. 2).

Объем инкубационной смеси в измерительных кюветах (2,25 мл) кондуктометрической установки, например Фермеит-1, опредЕлен емкостью ее кювет (2,5 мл) °

Янгибитор протеолиза в контрольной кювете (контрикал или тразилол) ,используют в концентрации 1000

6000 Ед в объеме 0,05 — 0,15 мл.

Пример определения осмотической резистентности лейкоцитов при граничных значениях параметров приведен,I .в т .абл., 2.

Уровень электропроводности в значительной мере зависит от темпераt туры, при которой протекает исследуемая реакция. Поэтому все кондук-, тометрические измерения проводят с обязательным и строгим соблюдением постоянства значений температуры в измерительных кюветах.

Предлагаемый способ в значительной мере автоматизирован, требует в 4 раза меньших затрат времени, по сравнению с известным качественным способом обладает более высокой точностью (ошибка кондуктометрического способа не превышает 4 Ъ, тогда как ошибка метода при подсчете лейкоцитов в камере составляет 7 %) .

Ф Таблица 1

909635

Продолжение табл. 1

Продолжение табл. 1

13500

1,16

4500

084Î

5000

1 04

0,39, 0,37

0,95

14000

5500

l 9000

25000

0i83

6000

0,36

0,80

6500

0,35

0,74

0,34. 7000

0,69

7500

0,33

0 65

8000

О,зг

0,61

8500

0,31

0>58

9000

0,30

0,29

0,54

9500

0,52

0,27

12500

0 50

0,47

0,45

0 26

0,20

0,43 ЗОООО

0,17

0,42

Таблица2

Показатели осмотического лейколизиса

Граничные значения параметров

36 45

Ьбс.В Ъ абс.Ъ % абс.В Ъ або.Ф %. абс. 3 Ф

Концентрация буферного раствора;М

1,3 10

5 10

2l 47,0 29. 23 5 33 17 6 36 11,8 38 О

18 43„7 25 25,0 29 18,7 32 12,5 34 0

Объем лейковзвеси; мкл

250

1l . 37,5 17 31,2 22 18,7 25 12,5 27 0

18 38,9 25 27,8 30 16,7 33 16,7 36 О

Концентрация антиферментнйх препаратов-ингибиторов протеолиза, Ед

1000 (контрикал)13, 6000 18

35,7 18

44,4 26

28 6 22 21,4 25 14,3 27 0

27,8 31 16,7 34 11,1 36 0

Формула изобретения чаюций измерение суммарного электрического сопротивления лейкоцитарной

1. Способ определения осмотичес- взвеси в инкубационной среде, о т кой резистентностн лейкоцитов, вклв- я я и ч а в шийся тем, что, с

909635

4б к№н

18 27

@гад

Составитель A.Ìàêàðîâ

Редактор С.Крупенина Техред М. Рейвес Корректор A-Ференц

Заказ 2418 . . . ..Тираж.883 . ..... ...Подписное.

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,.4 целью повышения эффективности и точ ности определения, в качестве инкубационной среды используют гипоосмолярную смесь, состоящую иэ 5,0 мл

1,3 10 - 5-1(Г» М буферного раствора с рН 6,0 - 8,0, лейкоцитарную взвесь вносят в количестве 100

250 мкл, после чего полученную среду вносят в равных объемах в контрольную и опытную кюветы кондуктометрической установки, затем в контрольную кювету добавляют 0,15 — 0,05 мл ингибитора протеолиэа и измеряют изменение суммарного электрического сопротивления лейкоцитарной взвеси в опытной кювете по отношению к контрольной.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ н и с я тем, что в качестве ингибитора протеолиза используют контрикал или траэилол в дозе 1000

6000 Ед.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Сененко A.Н. Лабораторное дело, 1 962, Р 7.

2. Демьяненко С.М. Проблемы туберкулеза, 1979, 9 8.