Способ получения препарата иммобилизованного субтилизина

 

ОПИСАНИЕ <910667

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскик

Соцюалнстмчвскмк

Респубпми (61) Дополнительное к ввт. свнд-ву (22)Заявлено 29.10.80 (2I ) 2995303/23 05 с присоединением заявки М (23)Приоритет

I (5! )М. Кл.

С 08с 289/00

С 07G 7/02

Екудввстееввй «ееиет

CCCP

«в Йв«ап «звбрвтвввй

«впуыей

Опубликовано 07.03.82 Бюллетень М

Г

Дата опубликования описания 09.03.82 (53) УДК 577, . 1 5 (088. 8) И. 10. Сахаров, Н. И. Ларионова, H. Ф. Каэанс

3. Ф. Василькова, П. И. Толстых и P. К. Абоя

Березин, (72 ) Авторы изобретения

И44И . университет,"

Йтут - -,.

- -.-м,-.ъ

Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской и ордена Трудового Красного Знамени государст

- им. М. В. Ломоносова н 1-й Московский орден н ордена Трудового Красного Знамени медицин им. И. М. Сеченова (71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИММОБИЛИЗОВАННОГО

СУБГИЛИЗИНА

Изобретение. сттносится к области химии полимеров, а именно к способу попу чения препарата. иммобилизованного субтилизина.

Препарат иммобилизованного субтидизина используют в медицине при лечении .гнойных p&H. .Известен способ получения препарата иммобилизованного субтилизина путем ковалентной иммобилизации субтилиэина иа природном полимере )1) t

Для этого к 100 мг диазотированного аминоарильного производного крахма- ла, суспензированного в 4 мл 0,1 М фосфвтного буфера (рН 7,8), медленно .прибавляют 3 мл 0,5%-ного раствора субтилизина в том же буфере, Реакцию проводят при церемешивании в течение

16 ч при 4 С. Дпя отделения неиммобилизованного белка нерастворимый препарат отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают раствором КС, à затем дис тиллированной водой. Полученные препара2 ты содержат 1-1,5 мг фермента на грамм носителя.

Недостатками этого способа являются сложная технология, невысокое содержание

5 субтилизина в препарате, в также то, что смола на основе крахмала не является пленкообрвзующей и биорвзпагаемой.

Известен способ получения препарата иммобилизованного субтилизинв путем ковапентной иммобилизации субтилизинв на карбоксиметилцеллюлоэе (21

Для этого гидраэид кислоты, полученной из нерастворимой карбоксиметилцеллюпозы, содержвшей 3,2 миллиэквиввлента карбоксильных групп на грамм препарата, суспензируют в 0,5 К НСт, в затем к. суспензия по кщтлям при интенсивном перемешивании добавляют 59 -ный водный раствор NoNOg при 0-2оС. По прошествии 20 мин реакцию заканчивают, промывая целлюлозный порошок на фильтре холодной дистиллированной водой. Полученный активированный носитель сразу помещают в 1%-ный раствор субтипизинв

3 910667 4 при РН 8,5. Реакцию проводят в течение шивают с 0,02%-ным водным раствором

2 ванин Препарат иммо-, субтилиэина, шт. 72, в объемном соотно2 ч при перемешивании. р билиэованного субтилизина промывают на шенин, .равном 0,25. Полученный раствор фильтре раствором МЮ и дистиллирован- переносят в кювету из плексиглаза и су- кой водой. Препарат содержит 60 мг .> шат при 25 С в течение 2 дней. Высусубтилиэина на гра бт на грамм носителя. щенную пленку, содержащую субтилизин, Недостатками этого способа являются погружают в 1%-ный раствор глутаровосложнвя технология, невысокое содержа- ro альдегида в фосфатном буфере ние субтилизина, а также то, что исполь-. (РН 8,0) на 30 с при 250С. Пленку отзуемы носитель не являетс и является пленкообра- iy мывают от избытка глутарового альдегиэующим и биоразпагаемым. да дистиллированной водой. Полученный препарат иммобилизоввнного субтилизина

Наиболее близким по технической содержит 10 мг фермента на 1 r коллас ущности и достигаемым результатам,.е„а Иммобилиэованный субткпизин хра-. о (базовый объект) является способ полу- s нят в сухом виде при 4 С. чения препарата иммобилизованного суб- Пример 2. 0„5 -ный раствор колованный тилиэинв IPJT&pA KoBBBeHTH06 иммобилизв J18I eHG HpeELB&pHT8JlbHo oTQHBJIB3OB8HHb цин субтилизина на природном полимере — против дистиллированной воды, смешивадиэтиламиноэтилсефадексе (3) ют с 0,32%-ным раствором субтилизинв, ЙЭАЗ-сефвдекс, предварительно акти- 20 шт. 72, в объемном соотношении, равном

aHPo HH IN бро шианом, помещт. в 20. Полученный раствор переносят в 1%-ный РаствоР субтилизина при,РН 10,0. вету иэ.ппексиглаза и суш р

Реакцию пРоводЯт в гечение 20 час пРи течение 5 дней Цысушенную пленку

4 С и постоянном перемешивании. Полу- содержащую субтилиэин, погружают в ченный продукт промывают 1М NaСВ, Zs 10% ный раствор глутарового альдегида

0,1М УНСО 3 и дистиллиРованной водой. в фосфатном буфе е (РН 7,0) на 60 с

П епаРат иммобкпизованного сУбтилиэинв при 1 7 C Пленку отмывают о от избытка содержит 23 мг фермента нв грамм но- глутарового альдегида дисгиллированно л ованной

Недостатками этого способа ЯвлЯютсЯ Е ванног о субтилизина содержит 12 мг аксложнаЯ технологиЯ, включаюшаЯ исполь- тивного фермента на 1 г коллагена. Имзование токсичного бромциана, невысокое мобилизованный субтилизин хранят в сусодеРжание сУбтилизина в пРепаРате и то, хом виде при 4оС что 93А3-целлюлоза не является пленко

Пример 3. 0,6%-ный раствор

Белью изобретения является получение коплагена, предварит

3s и е ительно отдиалиэованный би взлагвемого пленкообразующего прь- против дист иро илл ванной воды, смешиввиорв

5%ным водным аствором субтилив та повышение содержания субтилизи- ют с 5%ным днь р вор мном соотношении, на в препарате и упрощение технологии зина, шт. 72, в обьемном с раином 4. Полученный раствор переносят процесса.

49 и сшат и получения препарата имм епврата иммобипиэованного 20©С в течение 3 дней. ысушенную с бтилизина путем ковалентной иммоби- пленку, содержащую субтипиэин, погружасу тилизина путем о

%- и аств г тв ового апь л иэации субтилизина нв природном поли- ют в 10%-ны раствор лу р мере 0,02-5 -ный водный раствор суб- дегида в фосфатном уфер р б е (Н7,8) на водным раствором коллагена в объемном избытка глутарового альдегида дистнлпиотношении 0,25-20, воду удаляют испа- рованной водой. Полученный препарат им17-250С и полученную плен- мобилизованного субтилиэинв содержит еига на 1 г копку обрабатывают 1-10%-ным водным 340 мг активного фермеига на

Иммобипизованиый субтилизин раствором гпутарового альдегида в тече- и лагена. Иммобипиз и убтилизин виде и 4оС. ние 30-60 с при РН, 7-8 и 17-25оС хранят в сухом виде при

Перед использованием для удаления Поаученные препараты иммобнпизоввннизкомол екулярных ек я ных примесей раствор коп- ного субтилиэинв исцопьзуют при лече;лагена отдиапизовывают вают против дистилли- нии плоскостных кожно-мышечных гно ных ран в межлопаточиой области кролированной воды.

Пример ., ны р

1. 2 5%-ный вствор ков. Все препараты полностью растворяколлагена, пред р, п едварительно отдиалиэован- ются в течение одних суток, уменьшая иый против дистиллированной воды, сме- время очищения н заживлении раны.

5 - 910667

-Таким образом, и, оведеиие роцесса, нием при 17-25оС и олученну о пленку по способу изобретения позволяет унрос, обрабатывают 1-10Фным водным рас тить технологию получения препарата вм- . вором глутарового альдегида в течение мобилизованного субтилиэина, повысить 30-60 с при рН 7-8 и 17-25 С. содержание субтилизина в препарате. и > . Источники информации, получать биоразлагаемые пленкообраэую- принятые во внимание при экспертизе . < шие препараты. 1.L.Goldstein and others. Mater insoluble enzymes Synthesis of à пеи

carrier and its utl lizatlon for pre"

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и a je paration of insoluble derivatives

of papa in, tryps in and subt l lopept iСпособ получения препарата иммоби- dase А, Biochemistry, 1970, 9, 2322лиэованного субтилиэина путем ковалеит- 2334. ной иммобилизации субтилиэина на при- 2 М. Brummer and,orhers, Ргерагайоп

-родном полимере, о т л и ч а ю ш и и -

0,02-5,0%-ный водный раствор субтвп,- щ йочо chemical l.y a tached to зо1цЫе зина смешивают с 0,5-2,5%-нымводным ОЕАЕ-dextran and insoluble ВЕАЕ-sepраствором коллагена в объемном соотно- hadex, Biochem, Blophys. Acta, f978, шенин 0,25-20, воду удаляют .испаре- 492, 954-963.

Составитель Л, Валуев

Редактор О. Юркова Текред Л. Пекарь Корректор Н. Степ

Заказ 1023/27. Тираж 512 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж35, Раушсиая наб., д. 4/S филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4