Способ количественного определения адренорецепторов в клеточных мембранах

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскик

Социалистических

Республик

<1>918831 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (51) М. Кл.з (22) Заявлено 210580 (21) 2928187/30-15 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

G 01 N 24/10

G 01 N 33/50

Госуларстаеииый комитет.СССР

I10 ленам изобретений н открытий (ЗЗ) УДК 543. 4А 5..062:616-076 (088. 8) Опубликовано 070482. Бюллетень ¹ 13

Дата опубликования описания 070482 (72) Авторы изобретения

П.N.Ëìèðîâ, С.П.Смотров, И.Г.Шанявский и Д-Б.Сапрыгин

Ц А () c(";".";Ъ3 и @ф@фщ н в (71) Заявитель

Таджикский государственный универси (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ В КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАНАХ

К вЂ” З вЂ” «О

25 биогенный амин, выбранный из группы: адрена.лин, норадреналин и иэопротеренол;

Изобретение относится к исследованию биологических веществ, в частности к способам количественного определения адренорецепторов в биологических объектах, и может быть использовано в иммунохимии для анализа, например, клеточных мембран.

Известен способ количественного определения адренорецепторов в клеточных мембранах, включающий взаимо- действие исследуемого объекта с меченым биогенным амином, а затем с . немеченым соединением иной химической структуры и сравнение результатов специфического и неспецифического связывания меченого биогенного амина с исследуемым объектом. В качестве меченого биогенного амина используют радиоактивномеченый биогенный амин. Причем сначала один образец биологического объекта в виде гомогенизата подвергают взаимодействию с радиоактивномеченным биогенным амином, затем отмывают избыток непрореагировавщего соединения и измеряют радиоактивность образца. После этого второй с.бразец биологического объекта подвергают взаимодействию

;с адреноблокатором, а затем с радиоактивным меченым биологическим амином, отмывают избыток непрореагировавшего соединения и измеряют радиоактивность второго образца. Сравнивая радиоактивность первого и второго образцов судят о количестве адренорецепторов в клеточных мембранах (1) .

К недостаткам известного способа относятся невысокая точность количественного определения, длительность анализа, использование двух различных образцов биологического объекта и нестабильность радиоактивномеченого биогенного амина.

Целью изобретения является повышение точности, информативности и интенсификации способа.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве меченого биогенного амина используют спин-меченый биогенный амин общей формулы

918831 спиновая метка в виде стабильного иминоксиль- 5 ного радикала, после взаимодействия исследуемого объекта со спин-меченым биогенным амином регистрируют первый спектр электронного парамагнитного реэонан- )0 са полученного состава, затем тот же состав подвергают взаимодействию с нативным биогенным амином и регистрируют второй спектр электронного парамагнитного резонанса полученного но- )g вого состава, после чего по разности амплитуд второго и первого спектров судят о количестве адренорецепторов в исследуемом объекте.

Пример 1. Количественное определение cL--agpesopegenxopoa.

Образец миокарда кролика подвергают гомогениэации при -5 С. 1,8 мг спин-меченого норадреналина растворяют в 0,5 мл трис-HCt буфере, рН 7,05. К этому раствору прибавляют 5 мг гомогениэата и инкубируют при 37 С .10 мин. Затем полученное соединение промывают трижды по 5 мл охлажденным трис-HCE буфером (pH 7,05) и промытый состав переносят в стеклянную ампулу.. лпулу помещают в резонатор спектрометра электронного парамагнитного резонанса и регистрируют первый спектр, амплитуда которого характеризует количество неспеци- 35

Фически связанного с сопутствующими белками исследуемого объекта спинмеченого норадреналина. После этого, используя колибровочный график эа:зисимости амплитуды спектра от кон- 4р центрации спин-меченого норадреналина рассчитывают количество неспециФически связанного спин-меченого норадреналина.

Затем к гомогенизату, находящемуся в ампуле, прибавляют 5 мкл трисНС3 буферного раствора, рН 7,05, содержащего 0,5 мг нативного (битартрата) норадреналина и повторно инкубируют при 37 С в течение 10 мин.

При этом молекулы нативного (немеченого) норадреналина вытесняют в раствор молекулы спин-меченого норадреналина, поскольку обладает большим сродством к адренорецепторам. Далее регистрируют второй спектр электронного парамагнитного резонанса и по колибровочному графику определяют количественное значение суммы специФически и неспецифически связанного норадреналинй. Сравнивая первое и 60 второе измерение определяют количество специфически связанного адренорецепторами спин-меченого норадренали.на. Это значение соответствует

3,4 .0,3 мкм/мг гомогениэата и харак- 65 териэирует количество биологически активных адреиорецепторов.

Пример 2. Количественное определение (-ацренорецепторов.

Образец миокарда кролика подвергают гомогенизации при -5 С. 1,5 мг спин-меченого иэопротеренола растворяют в,0,5 мг трис-НСь буфере, рН 7,05.

К этому раствору прибавляют 5 мг гомогениэата и йнкубируют при 37 С

10 минут. Затем го логенизат промывают трижды по 5 мл охлажденным трисНСВ буфером (рН 7,05) и переносят в стеклянную ампулу. Ампулу помещают в резонатор спектрометра электронного парамагнитного резонанса и регистрируют первый спектр. Затем к гомогенизату, находящемуся в ампуле, прибавляют 5 мкл трис-НС буферного раствора, рН 7,05, содержащего .0,3 мг нативного гидрохлорида изопротеренола и повторно инкубируют при 37 С в течение 10 мин. Ампулу снова помещают в резонатор спектрометра электронного парамагнитного резонанса и снимают второй спектр. По калибровочному графику, исходя иэ амплитуды второго спектра, определяют количественное значение суммы специфически и неспецифически связанного спин-меченого иэопротеренола. По амплитуде первого спектра, используя калибровочный график, определяют количество неспецифически связанного спин-меченого изопротеренола. Затем по разнице между вторым и первым измерениями рассчитывают количество специфически связанного Ib -адренорецепторами спин-меченого изопротеренола.

Полученные результаты сведены в таблицу.

Среднее количество специфически связанного спин-меченого изопротеренола равно 2,83 мкг/мг. Эта величина характеризует количество (-адренорецепторов в образце миокарда кролика.

Выбор того или иного биогенного амина и спин-меченого биогенного амина для использования зависит от типа определяемых адренорецепторов и диктуется способностью взаимодействия с ними. Этой же причиной определяется количество исходных компонентов, участвующих в реакциях, которое для каждого конкретного случая использования способа может быть различным и выбирается различным у- . тем.

Предлагаемый способ обладает повышенной точностью определения, поскольку используеМЫе спин-меченые биогенные амины являются стабильными химическими соединениями, в которых метка .присоединена ковалентно, что

918831

Количество специФически свяэанного спин-меченого иэопротеренола, мкг/>лг

2,8 2,9 2,8 2,8 2,7 2,8 2,9 2,9 2,8 2,9

Формула изобретения, 0 р биогенный амин, выбранный иэ группы: адреналин, норадре- 40 калин и иэопротеренол; где К

Составитель Л. Рубинова

Редактор Л;Лукач Техред Е. Харитончик Корректор О. Билак

Заказ 2128/26 Тираж 883 Подписное

ВЧИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва,, Ж-35, Раушская наб., д; 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 позволяет провести точное определение с помощью спектрометрии электронного параиагнитного резонанса. Этим же Фактором обусловлена и повышенная информати: ность о состоянии клеточных мембран биологического объекта,5 поскольку чем точнее определено коНомер образца 1 2 3

Способ количественного определения адренорецепторов в клеточных мембранах, включающий взаимодействие исследуемого объекта с меченым биогенHEiM амином, а затем с немеченым соединением ийой химической структуры и сравнение результатов специфического и неспецифического связывания меченого биогенного амина с исследу» емым объектом, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности, информативности и интенсификации способа, в качестве меченого биогенного амина используют спин-.меченый биогенный. амин общей Формулы личество адренорецепторов, тем больше информации можно получить-о состоянии симпато-адреналовой системы организма. Кроме того, время анализа сокращается с 2 ч до 30 мин, а также способ позволяет снизить расход биологического материала.

4 5 6 7 8 9 10 — Я Ж вЂ” » 0- спиновая метка в виде стабильного иминоксильного pat дикала, после взаимодействия исследуемого объекта со спин-меченым биогенным амином регистрируют первый спектр электронного парамагнитного резонанса полученного состава, затем тот же состав подвергают взаимодействию с нативным биогенным амином и регистрируют второй спектр электронного парамагнитиого резонанса полученного нового состава, после чего по разности амплитуд второго н первого спектров судят о количестве адренорецепторов в исследуемом объекте.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Brain Research, 1978, 159, р. 125-135.