Способ определения жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий в нитрагине

 

Союз Советскин

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ iu935529 (61) Дополнительное к авт. свил-ву (22) Заявлено 10.09.80 (21) 2983785/30 — 15 с присоединением заявки,% (28) Rðèîpèãåò (51)М. Кл.

С 12 Й 1/00//

С 05 F ll 00

5Ьвудвротввнный комитвт

СССР

Опубликовано 15 06 82 Б оллетеиь Рй 22 по делам изобретений и открытий (53) УДК 63:576.8:

:631.8 (088.8) Дата опубликования описания

Ю. Т. Калинин, А. Н. Мезенцев, В. Х. Тихонов, В. Л. Земляков, Б. И. Голод и E. В. Чекасина (72) Авторы изобретения

Всесоюзный научно — исследовательский институт биологического приборостроения ..C (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК

КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ В НИТРАГИНЕ

Изобретение относится к сельскохоэяйствеи ной микробиологии и может быть использовано в сельском хозяйстве.

Известен способ определения количества жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий, который заключается в том, что водную суспенэию препарата высевают на элективную огариэованную питательную среду (1).

Однако способ требует для осуществления значительного времени (8 — 10 дней) из — за мед10 ленного роста клубеньковых бактерий на питательной среде.

Известен также спосос определения микроорганизмов с помощью флуорогенных субстратов эстераз, по которому клетктт микроIS организмов инкубируют при 37 — 40 С в течение 10 — 15 мин с флуорогенными субстратами эстераз, имеющими конечную концентрацию 0,5—

2,0 мкгбмл, после чего суспенэию просматривают в люминисцентом микроскопе и регистрируют флюоресцирующие клетки (2) .

При использовании данного способа в суспен зии нитрагин он не дает возможности проводить такое определение, так как применяемые в способе концентрации флуорегснных субстратов эстсраз (флуоресцендинацетата и флуоресцеиндибутирата 2,0 — 0,5 мкг/мл) практически не окрашивают клетки клубеньковых бактерий.

Целью изобретения является сокращение времени определения и повышение его точности. Поставленная цель достигается тем, что согласно предлагаемому способу водную суспензию нитрагина инкубируют с флуорогенным субстратом — эфиром низшей жирной кислоты (например, с. флуоресцеиндибутиратом), в конечной концентрации 50 — 100 мкг/мл, причем для усиления флуоресцентной окраски клеток инкубацию проводят при 50 — 55 С.

При инкубации клеток с флуорогенным субстратом, не обладающим флуоресценцией, эстеразы жизнеспособных клеток гидролизуют его и освобождающийся флуорохром накапливается в клетках, придавая им яркую флуоресценцию.

При использовании в качестве флуорогенных субстратов эфиров низших жирных кислот клетки мертвых микроорганизмов и час- тицы наполнителей (торфа, мела и т. д.), ооизме935529 римые с размером клеток, при подобной окраске обладают слабой флуоресценцией или не имеют се.

В качестве флуорогенных субстратов могут использоваться сложные эфиры флуорохромов, содержащих гидроксильную группу, и низших жирных кислот. Наиболее доступными являются флуоресцеиндиацетат и флуоресцеиндибутират. Тах как флуоресцеиндибутират более устойчив при хранении, имеет значительно меньшую степень спонтанного гидролиза, более дешев, чем флуоресцеипдиапетат и дает практически такую же картину при окраске клеток, то его использование предпочтительнее.

В зависимости от задач анализа могут использоваться и другие эфиры, вызывающие свечение жизнеспособных клеток в других областях спектра.

Лучшее окрапливание клеток в суспензии нитрагина достигается при применении субстратов в когшентрапиях от 50 до 100 мкг/мл.

При окраске субстратами в концентрации ниже 50 мкг/мл наблюдается слабое окрашивание жизнеспособных клеток, при котором визуальный счет клеток затруднен и сопровож. дается большими оцзибками, Низкие концент-. рации субстратов (меньше 1,3 мкг/мл), используемые в известном способе, практически не окрашивают клетки клубеньковых бактерий

Повышение температуры инкубации с 37— о о

40 С до 50-55 С приводит к увеличению сигнала флуорссценции клеток при окраске большими концентрациями флуоресцеиндиацетата в среднем на 40%. Подобная картина отмечается и в случае применения флуоресцеиндибутирата.

Визуальный подсчет клеток удобно проводить под люминесцентным микроскопом в клеточных препаратах, плиготовленных по Виноградарскому — Шульгиной. Способ в визуальном варианте счета может использоваться и для предварительной оценки содержания в образце жизнеспособных клеток посторонней !

Таблица ) Состав пробы

Сигнал люминесценпии от клеток относительные единицы, Mkm, n=20

Жизнеспособные клетки

Мертвые клетки

45ь3

52+2

Ризобин + флуоресцеиндиацетат

100 глкг/мл

Рнзоторфин +флуоресцеиндибутират 100 мкг/мл микрофлоры, отличающихся морфологнчески от клеток клубеньковых бактерий. Общая длительность анализа при применении пенного способа составляет !,5-2 ч: получение водной суспензии нитрагина 1 ч (Ilo ТУ), инкубация суслензии с субстратом 15 мин, счет клеток в клеточном препарате визуально 30--40 мнн, счет в суспензии автоматически 5- !О мин.

На чертеже показана зависимость величины

I0 сигнала люминесценции отдельных клеток клубеньковых бактерий в ризоторфине от концентрации флуоресцеиндиапетата и температуры инкубации.

Ось абсцисс — темлература инкубзнии; ось ординат — величина сигнала люминесценции; кривая 1 — 100 мкг/мл флуоресцсинднацетата в растворе; кривая 2 — 50 кривая 3 — 2 кривая 4 — 0,5

Сигналы люминесценции сняты на микроскопе Люмам И вЂ” 1 с помощью фотометричсской насадки.

Предлагаемый способ осуществляют следуюшим образом.

П р и м с р 1. К 0,9 мл водной суспензии риэобина, приготовленной известным способом, добавляют 0,1 мл раствора фгуоресцеиндиацетата в ацетоне (1 мг/мл), инкубируют

ЭО о при 55 С в течение 15 мин, затем добавляют

1 мл 006%-ного агара, перемешивают, наносят

0,02 мл на участок предметного стекла пло 2 щадью 6 см, равномерно распределяют суспензию по площади, подсушивают и считают флуоресцируюшие клетки известным способом.

Пример 2. К 0,8 мл водной суспензии ризоторфина приготовленной известным способом, добавляют 0,1 мл раствора флуоресцеинднбутирата в ацетоне (1 мг/мл) и обрабатывают как указано в примере 1.

Данные экспериментов приведены в табл. 1.

5 935529 6

Сравнительные данные по определению способами: предлагаемым и контрольным почисла жизнеспособных клубеньковых бактерий сева на питательную среду представлены в в одних и тех же партиях нитрагина двумя табл. 2.

Таблица 2

Количество жизнеспособных клеток в образце по способу, %

Продукт предлагаемом у контрольному

Окраска флуоресцеиндиацета том (длительность 2 ч) Посев на питательные среды (длительность

8 — 10 дней) 95

Ризобин

Ризоторфин

100

1 и для определения жизнеспособных клеток других видов микроорганизмов, используемых в микробиологической промышленности.

Формула изобретения

Иэ табл. 2 видно, что предлагаемым способом определяется практически такое же количество жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий в нитрагине, как и контрольным посева на питательные среды, применяющимся на производстве.

Применение предлагаемого способа дает положительный эффект, так как способ позволяет практически сразу же мосле получения продукта проводить анализ и отправлять его потребителю, а не хранить 8 — 10 дней на складе, пока проводится анализ способом, при. меняемым в промышленности, в результате

35 чего часть клеток в продукте погибает.

Способ может использоваться для определения числа жизнеспособных клеток клубеньковых .бактерий в культуральной жидкости, взятой из ферментера иа разных стадиях ферментации, т. е. может использоваться для контроля процесса ферментации.

Способ был успешно испытан при анализе ризобина на Лотошинском биохимическом заводе, кроме того, он может применяться

Способ определения жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий в нитрагпне, включающий инкубирование суспензии нитрагина с флуорогенным субстратом эстеразэфиром низшей жирной кислоты и регистрацию флуоресцируюших клеток, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени определения и повышения.его точности, обработку проводят концентрациями субстрата в интервале 50— 100 мкг/мл, причем для усиления флуоресцент ной скорости клеток инкубацию клеток проо водят при 50-55 С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. ТУ 59 — 91 — 76, 2. Mvdopatho1ogia, 66, N 3, р. 175, 1979 (прототип) .

935529

Составитель M. Дранишников

Техред А.Ач Корректор В. Синицкая

Редактор А. Гулько

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Заказ 4158/31 Тираж 505

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д..4/5