Способ получения ферментного комплекса

 

inj943279

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 05 08.80 (21) 2970009/28-13 с присоединением заявки ¹

Р1 М К з

С 12 N 9/22

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий (23) Приоритет ($3) УДК 66З.11 (088. 8) Опубликовано 1 0782.Бюллетень HP 26

Дата опубликования описания 15. 07 ° 82 (72) Авторы изобретения

Т.В.Шахова, Г.И. Хомякова, Т.Ф.Фридман, A.A. Хагендорф и С М Малей (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА

Изобретение относится к способам получения ферментного комплекса, используемого для расщепления нуклеиновых кислот до нуклеотидов и нуклеозидов, которые находят широкое применение в медицине н научно-исследо,вателькой работе в биохимии и молекулярной биологии.

Ферментные комплексы, расщепляющие нуклеиновые кислоты, содержат ферменты типа нуклеаз и фосфатаз и получают как выделением из растительных и животных тканей, так и микробиологическим путем.

Наиболее перспективными являют- ся микробиологические способы.

Известен штамм Actinomyces соех1соРог A-66,продуцирующий ферментный комплекс, йоторый содержит 5-экзонуклеазу, фосфатазу и другие ферменты, причем активность 5-экзонуклеазы в условиях глубинного культивирования

400 ед/мл, а при культивировании в . производственных условиях в ферментере. - 600 ед/мл (1) .

Однако активность фосфатаэы в комплексе очень низкая, в то же вре-. мя он содержит высокоактивную дезаминазу, которая дезаминирует нуклеотиды, при этом сильно снижается выход целевого продукта — аденози= на и гуанозина.

Известен также способ получения

5-экзонуклеазы, включающий культивирование Actinomyces coefico6or шт

A-18 при 28-30 С и рН 6, 9-7,2 на жидкой питательной среде, содержащей.пшеничную муку и крахмал, прогидролизованные 0L-амилазой, сернокислый аммоний, мел и калий хлористый, и выделение фермента иэ культуральной жидкости осаждением органическим растворителем, в котором соотношение d.-амилаэы к пшеничной муке 0,5г:40г, мука, крахмал, сульфат аммония, мел и калий хлористый взяты в соотношении 2: 2:О, 610, 6: О, 1 .

Время культивирования 48 ч при

30оС и аэрация 1 объем воздуха на

1 объем среды. Активность 5 -экзонуклеазы в культуральной жидкости

400 ед/мл. Ферментный препарат из фильтрата культуральной жидкости осаждают 2,5 объемами ацетона при рН

25 5,5 в присутствии магния хлористого (1 г/л). Активность 5 -экзонуклеазы в препарате 40 тыс.ед./г. Выкод препарата с 1 мЗ 8000 гlZ), Однако способ характеризуется отсутствием в ощутимых количествах

943279 фосфатазы и низкой ее активностью (следы), обусловленные недостаточным количеством катионов К+ в питательной среде, а также длительностью культивирования (48 ч), в связи с тем, что гидролиз пшеничной муки и крахмала при соотношении.с -амилазы ГхЗХ к пшеничной муке 0,5 r на 40 г муки проходит не до конца и не создает необходимое содержание олигосахаридов в питательной среде, что замедляет рост биомассы и продуцирование ферментов..

Цель изобретения — повышение фосфатазной активности ферментного комплекса при сохранении высокой

t активности 5-экзонуклеазы, а также сокращение сроков культивирования продуцента.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу .получения ферментного комплекса, содержащему

5 -экэонуклеазу и фосфатазу, включающему культивирование Actinomyces.

coeticoPor шт A-18 при 28-30 C и

РН 6,9-7,2 на жидкой питательной среде, содержащей пшеничную муку и крахмал, прогидролизованные с(амилазой, сернокислый аммоний, мел и хлористый калий, и выделение ферментов из культуральной жидкости путем осаждения органическим растворителем, в питательную среду дополнительно вводят активатор ферментов — хлористый марганец в концентрации 0,001-0,002% и пеногасительсиликоновое масло, при этом весовое соотношение d. — àìèëàçû к пшеничной муке составляет 1:(14-17), соотношение муки, крахмала и хлористого калия соответственно 1:(0,6-0,7):

:(0,07-0,08), а осаждение конечного продукта осуществляют этиловым спиртом при соотношении культуральной жидкости и спирта 1:(3,5-4,5).

Введение в питательную среду марганца хлористого в концентрации

0,001-0,002% активизирует и стабилизирует Ферменты 5 -экзонуклеаэу и щелочную Фосфатазу в процессе их биосинтеза и выделения из культуральной жидкости. Использование силиконового масла в качестве пеногасителя имеет то преимущество, что оно не обволакивает клетки мицелня и не мешает выходу ферментов из,клетки, что способствует увеличению концентрации 5 -экзонуклеазь и щелочной фосфатазы в культуральной жидкости. Проведение процесса гидролиэа d.-амилазой при соотношении aL-амилазы к пшеничной муке

1:(14-17) приводит к более полному разложению полимерной молекулы полисахаридов на олигосахариды, нвокрашиваемые йодом. Обогащение питательной среды олигосахаридами сокращает лаг-фазу и время .максимального накопления ферментов, что упрощает процесс получения ферментного комплекса за счет сокращения длительности культивирования на 8l2 ч. Соотношение пшеничной муки:

:крахмала:калия хлористого 1:(О,б0,7):(0,07-0,08) приводит к обогащению питательной среды аминокислотами и катионами калия. Это увели10 чивает количество биомассы и активирует продуцирование ферментов

5 -экзонуклеазы и щелочной фосфатазы.

Осаждение ферментного комплек-!

5 са этиловым спиртом при соотношении культуральной жидкости к спирту

1:(3,5 4,5) приводит к более полному осаждению щелочной фосфатазы из культуральной жидкости и обогащению

20 Ферментного комплекса Фосфатазой .

П .р и м е р 1. 15 кг пшеничной муки, разведенной в воде, заливают в ферментер, включают мешалку, доводят объем до 200 л и проводят стерилизацию муки острым паРом прн

2 кгс/см в течение 2 ч. По окончании сгерилизации давление в аппарате опускают, охлаждают до -95 С и загружают 10 кг растворимого крахмала, 0,9 кг ñ -амилаэы (амнлосубтилина

ГЗх) и проводят осахаривание. Затем загружают остальные компоненты, кг: аммоний сернокислый 3; мел 3; калий хлористый 1,05; марганец хлористый 0,005; силиконовое масло

0,20. Доводят объем до 500 л водой, РН среды 6,9. После загрузки всех компонентов питательной среды ферментер герметически закрывают и стерилизуют подачей пара в рубаш40 ку при 1 кгс/см в течение 1 ч.

После окончания стерилизации 12 литров трех суточной глубинной культуры Actinomyces coeQicofor шт. А-18 вливают в ферментер, включают мешал45 ку и подают стерильный воздух в ферментатор для аэрации. Процесс ферментации проводят при 29-30 С, давление в ферментере 0,5 кгс/см1> расход воздуха 30 мэ/ч при размешивании мешалкой со скоростью

300 об/мин. Выращивание ведут 40 ч.

По окончании ферментации культуральную жидкость фильтруют ° Получают

450 л фильтрата культуральной жидкости. В фильтрат добавляют 450 r магния хлористого и доводят РН до

5,5 с помощью 5 í. НС0. К охлажденному фильтрату культуральной жидкости приливают 3,5 объема охлажденного до 4 С этилового спирта и сушат в вакуум-сушильных шкафах. Активность

5 -экзонуклеазы 44300 c/r. Активность щелочной фосфатозы 910 с/r препарата.

Пример 2. К 18 кг пшеничной

65 муки в 200 л воды, простерилиэованной

943279

Формула изобретения

Составитель Е.Воробьева

Редактор Н.Киштулинец Техред Ж. Кастелевич

КорректорИ.МУска

Подписное

Заказ 5037/34 Тираж 505

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений.и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 в ферментере острым. паром при 2 кгс/см добавляют 12,6 кг крахмала и 1,3 кг амилосубтилина ГЗх и проводят осахаривание. Затем загружают остальные компоненты, кг: аммоний сернокислый 3,6; мел 3,6; калий хлористый 1,5; марганец хлористый

0,0075; силиконовое масло 0,3. Доводят объем до 500 л водой. рй среды

7,2. 12 л трех суточной глубинной культуры Actinomyces coefico9or шт. 10

A-18 вливают в приготовленную питательную среду и подают стерильный воздух для аэрации при включенной мешалке.

Процесс ферментации проводят при 29 С и давлении в ферментере

0,5 кгс/см1, расходе воздуха 30 м /ч при размешивании мешалкой 240 об/мин.

Выращивание ведут в течение 36 ч.

Активность 5 -экзонуклеазы в кульI туральной жидкости 480 ед/мл.

Культуральную жидкость фильтруют.

Получают 460 л фильтрата культуральной жидкости. К культуральной жидкости добавляют 460 г хлористого магния и доводят рН до 5,5 с помощью 5 н.

НС9. К охлажденному фильтрату культуральной жидкости приливают охлажденный этиловый спирт в соотношении

1:4,5 при перемешивании. После отстаивания в течение 20 мин суспен.зию фильтруют на нутч-фильтре.

Осадок фермента промывают этиловым спиртом и сушат в вакуум-сушильных шкафах. Активность 5 -экзонуклеазы 50100 е/r препарата. Активность щелочной фосфатазы 1020 е/г препарата.

Предлагаемый способ позволяет повысить активность фосфатазы в продуцируемом ферментном комплексе 4() при сохранении высокой 5 -экзонук( леазной активност, а также сократить сроки культивирования продуцента.

Способ получения ферментного комплекса, содержащего 5 -экэонуклеазу и фосфатазу, включающий культивирование Actinamyces coeticotor шт А-18 при 28-30 C и рН 6,9-7,2 на жидкой питательной среде, содержащей пшеничную муку и крахмал, прогидролизованные d.-амилазой, сернокислый аммоний, мел и .хлористый калий, и выделение ферментов из культуральной жидкости путем осаждения органическим растворителем, отличающийся тем, что с целью повышения фосфатазной активности ферментного комплекса при сохранении высокой активности 5 -экзонуклеазы, а также сокращения сроков культивирования продуцента, в питательную среду дополнительно вводят активатор ферментов — хлористый марганец в концентрации 0,0010,02% и пеногаситель — силиконовое масло, при этом весовое соотношение

d.-амилазы к пшеничной муке составляет 1:(14-17), соотношение муки, крахмала и хлористого калия соответственно 1:(О, 6-0, 7) г(0,07-0,08), а осаждение осуществляют этиловым спиртом нри соотношении культуральной жидкости и спирта 1:(3,5-4,5).

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

9 772224, кл. С 12 N 15/00, 1979

2. Авторское свидетельство СССР по заявке М 2659534/28-13, кл, С 12 0 13/10, 1978 (прототип).