Способ получения сахара из целлюлозусодержащего растительного сырья

 

Союз Советских

Социалистнческкк

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

< 949002

Ф

1 ! ,\,„;/ »7 ,г (6I ) Дополннтельнос к авт. свил-ву (22) Заявлено 27,11.80 (2! ) 3229125/28 13 с прнсоелнненнем заявки № (23) Прнорнтет— (51) М. Кл.

С 13 К 1/02

Гооударстаааый комитет

СССР

Опубликовано 07.08.82. Бюллетень №29 ио делам изобретений и открытий (53) УД1(663.534 (088.8) Дата опубликования описания 10.08.82

И.В. Березин, К. A. Калунянц, N. Л. Рабинович, A. А. Клесов, Л. С. Лосякова, Л. И. Голгер, В. М. Серебренников О. П. Кожемякина, (72) Авторы изобретения

Б. Н. Федоренко, Н. Г. Бочкарева, Э. М. Трефило Б.,4, Велйчко и Г. В. Черкасова " -с :- " :ЖАя

Р4осковский ордена Ленина, ордена Октябрьской рролфЯии, и ордена Трудового Красного Знамени государс 4нттый университет",

4 .,!- "! им.. В Ломоносова и Всесоюзный на но-исс дователйкяй (7I) Заявители

М Уч биотехнический институт Главного управления м робиолог тчесттс!й промьпиленности при CN СССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ САХАРОВ ИЗ

ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАШЕГО РАСТИТЕЛЬНОГО

СЫРЬЯ!

Изобретение относится к гидролизной промьппленности, в частности к способам, получения сахаров из целлюлозосодержашего растительного сырья, и может быть использовано в микробиологической, спиртовой, пишевой промышленностях и для

5 получени я кормов.

Известен способ получения сахаров из целлюлозосодержашего сырья, предусматриваюший адсорбцию целлюлолитических ферментов на сырье, гидролиз сырья, отделение жидкой фазы, содержащей олигосахариды, от непрореагировавших остатков с последуюшим гидролизом олигосахаридов иммобнлизованными целлюлозными ферментами, ковалентно связанными с тэердылт носителем, до глюкозы и выделение глюкозы из вторичного гидролизата (11 . 20

Недостатком данного способа является использование дорогостояших иммобилизованных ферментов, что значительно удорожает процесс гидролиза.

Известен способ получения сахаров из целлюлозосодержашего сырья, предусматриваюший адсорбцию целлюлолитических ферментов на целлюлозосодержашем сырье гидролиз сырья адсорбированными ферментами при рН 4-5 и 25 — 50"С, отделение жидкой фазы, содержашей сахара, регенерацию высвобождающихся ферл!ентов путем постоянного поддерживания избытка целлюлозы в реакционной смеси (2)

Недостатком описанного способа является неполная регенерация целлюлолитического кмплекса за счет потерь ферментов, адсорбированных на непрогидролизованных остатках сырья.

Известен также способ гидролиза растительного сырья, согласно которому для увеличения выхода сахаров в процессе гидролиза осушествляют принудительное подпрессование сырья до плотности 260—

300 кгlм о абсолютно сухого сырья (.3)

Наиболее близким техническим решением является способ получения сахаров из целлюлозосодержащего растительного сы3 94900 рья, предусматривающий адсорбшпо целлюлолитических ферментов на сырье, гидролиз его при рН 4,0 — 5,0 и 25 — 50 С, отделение непрореагировавших остатков и гидролизата, содержашего сахар, промывку > непрореагировавших остатков от ферментов и введение десорбирова п ых ферментов в процесс, регенерацию ферментов из гидролизата путем адсорбции их на вновь вводимом сырье с последуюшим выводом гидролизата из процесса (4 1 .

Недостатком данного способа является неполная адсорбция ферментов на сырье (около 50%) вследствие низкого содержания сырья в реакционной камере (5—

10 :" :-нам суспензия), что приводит к неполной регенерации фермента, а также к сниженто выхода сахаров на единицу сырья н на единицу объема реактора. Кроме того, необходима подача фермента на стадию гидролиза только в виде сухого препарата и невозможно использование фермента в виде раствора, водной вытяни технического препарата или купътуральной

>кидк ос ти, 25

Пель изобретения — повышение выхода сахаров на единицу сырья, а также более полное использование ферментов.

Поставленная цель достигается тем,, (\ что в способе получения сахаров из целпюлозосодержашего растительного сырья, предусматривающем адсорбцию целлюлолитических ферментов на сырье, гидролиз о его при кислых значениях рН и 25 - 50 С, отделение непрореагировавш цх остатков и гидролизата, содержащего сахара, промывку непрореагировавших остатков or ферментов, адсорбцию ферментов из гидролизата путем пропускания его через сырье и выделение гидролизата, перед адсорбцией ферментов целлюпозосодержашее рас тительное сырье прессуют до плотности 0,20,8 г/см, адсорбцию ферментов на сырье ведут при 0 - 20 С, а отмывание непро« реагировавших остатков от ферментов осу45 шествляют при рН 6 — 9.

При этом ферментный препарат используют в растворенном виде и пропускают раствор фермента через спрессованное сырье со скоростью 0,5 — 10 объемов реактора/ч.

Отделение гидролизата, содержащего сахара, осушествляют со скоростью 0,1—

5 объемов реактора/сут, и в качестве целлюполитических ферментов используют комплексные препараты, содержащие эндогпюканазу, целлобиогидролазу, экзоглюкозидазу, целлобиазу.

2 4

Сушность предлагаемого способа заключается в следуюшем.

При использовании ферментов в виде раствора или культуральной жидкости рН раствора устанавливают 3,5 — 5,0 целлюлозосодержашее сырье прессуют до плотности 0,2 — 0,8 г/см, температуру сырья

3 и раствора фермента поддерживают 5—

25 С. Ферментный раствор пропускают (-О через опрессованное сырье со скоростью

0,5 — 10 объемов реактора/ч и затем заменяют буферным раствором рН 4,0-5,0, снижают скорость его пропускания через сырье до О, 1-5 объемов реактора/сут, г повышают температуру сырья до 25 — 50 С и ведут гидролиз при постоянном удалении гидролизата, содержашего сахара. Полученный гидролизат пропускают через вновь вводимое в процесс спрессованное сырье при 5 - 25 С для адсорбции высвобождаюшихся при гидролизе ферментов. пдролизат, пропущенный через сырье, имеет со-держание сахаров 3 - 10%, из которых от 60 до 90 0 составляет глюкоза, а остальные 10 - 40% - целлобиоза и ксилоза.

В тоже время в сиропах, получаемых по известному методу, как показывают наши данные, глюкоза редко превьпнает 30-40% от обшего содержания сахаров, при использовании целл|олазных препаратов продуцента Т.Ч1 г1дб повышение относительного содержания глюкозы в гидролизатах при проведении процесса предлагаемым способом, возможно, объясняется более полной адсорбцией ферментов, образуюших глюкозу, экзоглюкозидазы и целлобиазы. Гидролизат может быть использован для выделения глюкозы в качестве компонента питательной среды при выращивании микроорганизмов, для получения спирта, для получения кормов. По мере накопления в процессе гидропиза непрореагировавших остатков сырья их выводят из зоны реакции и промывают буферным раствором с рН 6,09,0 для десорбции ферментов. Раствор, содержаший десорбированные ферменты, подкисляют до рН 4,0 — 5,0 и вновь вводят в процесс гидролиза, а непрореагировавшие остатки удаляют. В качестве целлюлозосодержашего сырья можно использовать отходы хлопка (пинт, гузапая), деревообрабатываюшей (опилки), целлюлозно-бумажной, вискозной промьпиленнос ти, городские отходы, отходы сельского хозяйства. В качестве ферментов могут быть использованы цеплюполитические комплексы, содержащие эндоглюканазу, целпобиазу, экзоглюкозидазу, целпобиогидролазу в виде культуральной жидкости, 2 6 в гидролизате на выходе из реактора 3 Мъ.

Содержание глюкозы в процентах от суммы общих сахаров 60%. Непрогидролизованный остаток выводят из зоны гидролиза, ферменты десорбируют путем промывания остатка буфером при рН 6,0. Значение рН промывных вод доводят до 4,5 и вновь подают на сырье, размещенное в зоне сорбцип реактора.

Пример 2. Условия проведения процесса гидролиза опилок аналогичны примеру 1 за исключением того, что через опилки пропускают 90 мл вытяжки при 20 С со скоростью 10 объемов реактора/ч. Скорость отвода гидролизата—

2 объема реактора/сут.

Пример 3. Отличие заключается в том, что используют ферментную вытяжку из препаратов целлолигнорин Пх с aicтивностью, ед/мл: по эндоглюканазе 5; экзоглюкозидазе 0(5; целлобиогидролазе 0,3, Через опилки пропускают 210 мл вытяжки со скоростью 6 объемов реактора/ч. Гидролизат отводят со. скоростью

1 объем реактора/в сут.

Пример 4. Ферментативный гидролиз измельченного хлопкового линта проводят с использованием комплексного препарата целловиридин ГЗх. Из препарата готовят 5О/-ный раствор в ацетатном буфере с рН 4,0. Активность в растворе, ед/мл: эндоглюканазы 1,2; экзоглюкозидазы 0,3; целлобиогидролазы 0,5; целлобиазы 0,05. Измельченный линт (120 г) смачивают ацетатным буфером с рН 4,0, переносят в реактор колонного типа объемом 350 мл, снабженный двумя рубашками для охлаждения или нагрева сырья, и прессуют до плотности 0,8 г/смЗ

Затем его и раствор фермента охлаждают до 15 и пропускают через сырье со ско ростью 1 объем реактора/ч (350 мл/ч);

По окончании процесса сорбции в реакционной зоне устанавливают режим гидролиза, для чего температуру в реакционной зоне поднимают до 25о. Одновремен« но в реактор вносят 60r свежего сырья, спрессовывают до плотности 0,8 г/см и с помощью второй рубашки охлаждают до 15 . В реакционную зону подают буферный раствор с рН 4,5 со скоростью

0,35 объема реактора/сут (120 мл/сут).

Гидролизат отводят через слой вновь введенного сырья, которое затем противотоком направляется в реакционную зону.

Непрогидролиэованный остаток сырья периодически удаляется, промывается буферным раствором с рН 9, а десорбируемые при этом ферменты вводятся в реакцион5 94900 полученной при выращивании продуцентов целлюлазы, таких как ТгiCtlo c3er tAcl ÷iriBe, Tr сподегп а koninqi, Тг1сйо8erma Oiqnorum, Ьео1гihum с а йЖ—

gu, Rgpepgi ЕЕц pi ег, gaper+. С6щ terrene, Ampere(;iИоь ое dies, 7гicbo der ma 6оп с 1Ьr achr o tun, и их смеси или препараты, выделенные из культуральной жидкости или полученные путем поверхностного культивирования, такие как целлокандин, целловиридин, целлолигнорин, целлоконингин, пектофоетидин и их смеси. При использовании ферментного препарата в виде порошка сухое целлюлозосодержащее сырье перемешивают с ферментным препаратом, полученную смесь прессуют, устанавливают температуру 5 — 25оС и через смесь пропускают буферный раствор с рН 4,0 — 5,0, температурой 5 — 25 С, скоростью 0,5 — 10 объемов реактора/ч. П о мере рас творения ферментного препарата в процесс вводят новые порции сырья. После полного растворения фермента процесс осуществляют описанным способом.

Пример 1. Ферментативный гидролиз делигнифицированных измельченных опилок проводят с использованием комплексного препарата целлоконингин Пх. Из это-зо го препарата готовят водную вытяжку.

Активность эндоглюканазы в вытяжке

8,5 ед/мл; экзоглюкозидазы 1 ед/мл; целлобиогидролазы 1,0 ед/мл; целлобиазы 1 ед/мл. Делигнифицированные измелт

35 ченные опилки суспендируют в буфере рН

4,5 и переносят в реактор для гидролиза колонного типа объемом 20 мл, оборудованный рубашкой для охлаждения или нагрева сырья. В реакторе опилки спрессовывают до плотности 0,45 г/см, охлаждают до 4 С и пропускают через него 140 мл вытяжки ферментного препарата, значение рН вытяжки предварительно доводят до

4,5 уксусной кислотой. Вытяжку прокачи45 вают через сырье со скоростью 0,5 объема реактора/ч (10 мл/ч). По окончании процесса сорбции устанавливают режим гидролиза, для чего температуру сырья с сорбированным ферментом доводят до

45 С. В зону гидролиза подается буфер50 ный раствор рН 4,5 со скоростью 4 объема реактора/сут. Гидролизат, содержавший сахар и ферменты целлюлотического комплекса, отводят и пропускают через новую партию спрессованного и охлажденного до 4 С сырья, ферменты из гидролизата сорбируют па сырье, которое направляют в зону гидролиза Концентрация сахаров

Э40002 ную зону. Содержание глюкозы в гидролизате от общей суммы восстанавливаюших сахаров составляет 90%. При адсорбции адсорбируется 80 - 100% ферментов (по методу прототипа — лишь 50 - 60%), а примеси (пигмент, балластный белок, компоненты питательной среды) адсорбируются менее, чем па 10%, н выходят из реактора до начала гичролиза. Благодаря этому сироп имеет лишь слабую окраску, хотя 10 используемый ферментный препарат был интенсивно коричневого цвета. Потери ферментов при непрерывном функционировании реактора в течение месяца и двукратном добавлении новых порций сы- 15 рья составляет менее 15%, а производительность реактора сохраняется почти на. постоянном уровне.

Пример 5. Процесс проводят ана.— логично примеру 4, но в качестве сырья используют хлопковый пинт, обработанный фосфорной кислотой (50 г) . Объем реактора 120 мл, сырье прессуют до плотности 0,2 г/см, используют культуральную жидкость продуцента Гг СИойЕг.ma Ю . дЕ с активностью, ед/мл: эндоглюканазы 1,0; экзоглюкозидазы О, 2; целлобиогидролазы

О,Э и целлобиаэы 0,03. Скорость пропускания культуральной жидкости через сырье при адсорбции фермента 60 мл/ч, темпе0 30 ратура адсорбции 25 . Скорость пропускания буфера с рН 4,5 в ходе гидролиза сырья 80 мл/сут, температура гидролиза

40 С, В выходящем гидропизате глюкоза составляет 60% от общего содержания

35 сахаров.

В таблице показана производительность реактора и концентрация сахаров, достигнутые в этих примерах.

1,2

5,5

Предлагаемый способ позволяет увеличивать продуктивность процесса за счет повышения количества ферментов, адсор55 бированных на единицу веса сырья, iTo приводит к увеличению выхода сахаров, и многократно испольэовать ферменты, вводимые в r.ðîèåcñ, за счет более полной адсорбшш их пз гидролизата и десорбцип с непрореагпровавших остатков.

1<роме того, предлагаемый способ позволяет иммобплизовать целпобиазу, содержащуюся в комплексе ферментов, адсорбцией непосредственно на расщепляемом сырье с сохранением до 30 — 50% активности это дает возможность получить гидролизаты с высоким относительным содержанием глюкозы и малой примесью целлобиозы, а также предотвратить ингибирование целлобиазой других компонентов целлюлаэного препарата, чего не удается избежать при отдельной иммобилизации цеплобиазы. Данный способ позволяет получить гидропизат не загрязненный примесями, содержащемся в ферментном препарате, а также использовать ферментные растворы с низкой активностью за счет концентрирования ферментов в реакционной смеси при адсорбции на сырье. Таким образом, увеличение выхода сахаров на единицу сыр я достигается за счет увеличения адсорбции ферментов на единицу сырья, а такде создания усло-. вий, при которых ферменты используются наиболее полно и эффективно гидролизуют сырье. При прессовании сырья до плотности 0,2 -0,8 г/см. ферменты адсорбируютЭ ся на сырье более полно (на 80 - 100%), чем в условиях по прототипу (5- 15% ная суспензия сырья, адсорбция на 50-.70%).

При проведении адсорбции при температурах, на 10 — 40 С ниже температуры гидо ропиза, т. е. при 0-20 С, адсорбция ферментов на сырье увеличивается в 1, 11,5 раза по сравнению с прототипом, где адсорбция идет в условиях гидролиэа.

Проведение гидролиза сырья в спрессованном виде позволяет поддерживать более высокую плотность сырья в процессе гидролиэа (0,2 - 0;8г/см ), чем по прото3 типу (5 - 15%-ные суспензии). При этом ярменты адсорбированы на сырье в большей степени и действуют эффективнее при том же количестве ферментов. Пропускание ферментного раствора через сырье со скоростью 0,1 - 10 объемов реактора/ч позволяет нанести на сырье большое количество фермента, не загрязняя реакционную зону ингибируюшими примесями, содержащимися в ферментном препарате, что позволяет создать оптимальные условия для действия ферментов.

В прототипе на стадии гидролиза в реактор добавляется сухой ферментный препарат, содержащий большое количество примесей, ингибируюших гидропиэ. Отделение в процессе гидролиза образуюше9 9490 гося сахарного сиропа и пропускание его через вновь вводимое спрессованное сырье при температурах, на 10-40оС ниже, чем при гидролизе, позволяет полнее адсорбировать на сырье ферменты, выводимые из зоны гидролиза с гидролизатом. В прототипе гидролизат приводится в контакт с 5 — 15%ными суспензиями свежего сырья при температурах, не оптимальных для адсорбции ферментов, в 30 результате чего адсорбция ферментов на сырье является менее полной. Промывание непрореагировавших остатков сырья раствором с рН 69 вызывает полную десорбцию ферментов с выводимых из 15 процесса остатков и позволяет возвратить их в процесс гидролиза. В прототипе промывание осуществляется водой с рН тем же,что и при гидролизе (4-5), а в этих условиях десорбция ферментов с остатков 2О сырья происходит труднее, чем при рН 69. Использование ферментного препарата, содержащего ферменты эндоглюканазу, целлобиогидролазу, экзоглюкозидазу и целлобиазу, позволяет повысить степень гидролиза сырья до 80 - 100 в результате синергизма в действии отдельных ферментов на сырье. В прототипе используются препараты, не содержащие экэоглюкоэидазы, они не обеспечивают столь 30 эффективного гидролиза сырья.

1. Способ получения сахаров из целлюлозосодержашего растительного сырья, предусматривающий адсорбщпо целлюлолитических ферментов на сырье, гидролиэ

его при кислых значениях рН и темпера- 4о туре 25 - 50 С, отделение непрореагио формула изобретения

02 10 ! ровавших остатков и гидролизата, содержащего сахара, промывку непрореагировавших остатков от ферментов, адсорбцию ферментов иэ гидролиэата путем пропускания его через сырье и выделение гидролизата, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения выхода сахара, перед адсорбцией ферментов целлюлоэосодержашее растительное сырье прессуют до плотности 0,2 -0,8 г/см, адсорбцию

3 ферментов на сырье ведут при 0 - 20оС, а промывание непрореагировавших остат ков от ферментов осуществляют при рН

6 - 9.

2.Способпоп. 1, о тличаю ш и и с я тем, что используют фермент ный препарат в растворенном виде, при этом пропускание раствора фермента через спрессованное сырье проводят со скоростью 0,5 - 10 объемов реактора/ч.

3. Способ по и. 1, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что отделение гидролизата, содержащего сахар, осуществляют со скоростью О, 1 - 5 объемов реактора/

/сут.

4. Способ по и. 1, о т л и ч а ю шийся тем, что в качестве целлюлолитических ферментов используют комплексные препараты, содержащие эндоглюканазу, целлобиогидролазу, экэоглюкозидазу, целлобиаэу.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

l. Авторское свидетельство СССР

N 562573, кл. С 13 К 1/02, 1975.

2. Патент США N 3764475, кл. 195-33, оцублик. 1973.

3. Авторское свидетельство СССР

No 234948, кл. С 13 К 1/02, 1965.

4. Патент США No 3 972775, кл. 195-33, опублик. 1976.

Составитель М. Ларина

Редактор К. Волощук Техред Л.Пекарь Корректор А. Гриценко

Заказ 5700/7 Тираж 371 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4