Способ получения пептидов или их солей

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

<, 957762

Союз Советских

Социалистических

Республик (6l ) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 04.12.75 (g) ) 2197544/23-04 (23) Приоритет — (32) 05. 12. 74 (5() М. Кл.

С 07 С 103/52

// A б1 К 37/02

Государственный комитет

СССР по делам нзобретеннй н открытий (3! ) 7415229-9 (33) Швеция

Опубликовано 070982 ° Бюллетень № 33

Дата опубликоваии>, описания 07. 09. 82 (53) УДК 547. 964. . 4. 07 (088. 8) Иностранцы

Лейф Эрик Аурелл и Карл Геран Клаесон (Швеция) (72} Авторы изобретения ( (;Г.. 3 <.1 . -.ртп0.

Т (ц )иГ ".(д» яИЬЛИОТ "А

Иностранная фирма

"Актиеболагет Каби" (ШвЕция) (71) Заявитель ф (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ ИЛИ ИХ СОЛЕЙ

Изобретение относится к способу получения пептидов - новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в биохимии и медицине.

В химии пептидов широко используют метод постепенного наращивания пептидной цепи за счет конденсации активированных аминокислот, например, способам активированных эфиров(11;

Цель изобретения — синтез новых пептидов, содержащих хромогенную группу, которые обладают интересными свойствами.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения пептидов общей формулы

R„ — A„- Ал- Гли — Apr — NHi >, где R< — водород, бензоил;

Rg - и нитроанилид )

А - аспарагинил, глицил, изолейцил, лейцил, валил, пролил, тирозил, фенилаланил;

А - глютаминовая кислота, глютамин, аспарагиновая кислота, или их солей, соединение общей формулы IgN R, в которой Rg имеет указанные значения, подвергают взаимодействию с соответствующей аминокислотой и далее требуемую пептидную структуру постепенно наращивают путем сочетания остальных аминокислот, причем группу Rg используют в качестве защитной группы для С-концевой карбоксильной группы первой аминокислоты.

Дпя наращивания требуемой пептидной структуры используют сочетания аминокислот методом активированных эфиров. . В этом ступенчатом синтезе пептидных производных используют хорошо известные в химии пептидов способы и защитные группы: карбобенэокси (Кбо), пара-метоксикарбобенэокси (МеОКб), пара-нитрокарбобензокси (NO> Кбо), пара-метоксифенилазо-карбобензокси (Икбо), трет-бутилоксикарбонил (БОК), трифторацетил (ТФА) или формил применяют в качестве аминозащитных групп; х-карбоксильную группу активируют путем конверсии в различные производные, которые или могут быть выделены или.получены "In situ" например, пара-нитрофениловый сложный эфир, трихлорфениловый, пентахлорфениловый, N-гидроксисукцинимидовый, азид и ангидрид кислоты, которые могут быть симметричными.или несимметричными.

957762

Ала-алании, Гли-глицин;, Apr-аргинин; Илей-изолейцин;

Асп-аспарагин; Лей-лейцин;

Аспа-аспарагиновая Мет-метионин; кислота;

Глю-глютамйн,". Фе-фе нилалани н;

Глю-глютами новая Про-пролин; кислота;

Тир-тирозин; Вал-Валин. другие сокращения:

Ац-ацетил; МкбО-метоксифенилаэокарбобензокси;

МеОН-метанол;

60

Ац О-уксусный ангидрид;

Могут быть активированы также N-карбодиимидом, например, N, N -.дициклогексилкарбодиимидом. Концевая карбоксильная группа в аминопептидном производном или производном аминокислоты может быть зацищена путем этерифи- 5 нации в метиловый, этиловый или изопропиловый эфир или путем превращения в хромофорное анилиновое производное, которое также выполняет функцию защитной группы во время наращи-10 вания пептидной цепи. Те свободные функциональные группы, которые не принимают участия в реакции во время синтеза пептидов или их производных, могут быть защищены следуюцим образом.

Дпя защиты остающейся аргинил- /—

-гуанидино-группы используют протонизацию, NO< или пара-толуолсульфонил (TOC). В качестве защиты карбоксильной группы в глютаминовой кислоте и аспарагиновой кислоте применяют бенэильную и трет-бутильную группы.

Для анализа элюатов и продуктов используют хроматографию в тонком слое силикагеля Fgg4 (Мерк) .

Используют следующие системы растворителей: А при объемном соотношении н-бутанол:уксусная кислота: вода, равном 3:1:1; С при объемном соотношении н-пропанол:этилацетат:вода, равном 7:1:2; Д при объемном соотношении п-гептан:н-бутанол:уксусная кислота, равном 3:2:1; Р при объемном соотношении хлороформ:метанол, 35 равном 9:1.

После хроматографирования в тонком слое пластинки просматривают в

УФ-свете (254 йм) и затем обрыэгива" ют хлор/толуидиновым. реагентом. 40

Далее применены следующие сокращения..

Аминокислоты.

Свободные аминокислоты или пептид указываются с помощью буквы Н у ами- 45 ногруппы и ОН у карбоксильной группы.

Аминогруппа всегда указывается, слева, карбоксильная группа справа.

Все применяющиеся аминокислоты имеют L-конфигурацию если не огово- 50 рено дополнительно.

ОтБ-трет.бутилокси;

ОЭТ-Этилокси

АцОН-уксусная кислота;

Бок-трет.бутилоксикарбонил;

БзОЛ-бензоил;

Бэл-бензил;.

Оме-метилокси;

ОпНФ-пара-нитрофенокси;

Бэ О-бенэойный ОиэоП-изопропилангидрид;,окси, КбО-карбобенз- пНА-пара-нитроани окси; лид;

Ддгкди-дициклогек- ТФА-трифторацетил силкарбодиимид;

ЭтЗ N-триэтиламин; TOC-пара-толуолсульфонил.

В примерах, если специально не оговаривается, температура O C.

Пример 1: НС1 Бзл-Илей-Глю-Гли-Apr-nIIA.

1а.Кбо-Гли-Apr (NO< )-пНА (Мол. вес,530,4).

Раствор 5,0 r (10,6. ммоль) Кбо-Арг (НО ) .-пНА в 21 мл АсОН и

22 мл 4 н. HBr в АсОН в безводных условиях перемешивают 1 ч при комнат,ной.температуре, затем медленно вливают в 200 мл эфира при энергичном перемешивании. Эфирный раствор отделяют декантацией, а полученный зернистый остаток обрабатывают два раза эфиром по 100 мл. После сушки в вакууме над Р О и таблетками КОН при

30 С получают бромистоводородную соль аминокислотного производного почти количественно (4,95 г) . Продукт гомогенный согласно тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе A.

Продукт растворяют в. 50 мл перегнанного диметилформамида, раствор охлаждают до -10 С и добавляют триэтаноламин до нейтрального значения рН (2,1 мл) . Выпавший в осадок бромгидрат триэтаноламина отфильтровывают и фильтрат охлаждают до -10 С. о

K раствору добавляют 3,9 г (11,8 ммоль)

Кбо-Гли-ОпНФ, смесь медленно нагревают до комнатной температуры. Через

3 ч раствор вновь охлаждают до

-100С и вносят 0,54 г (5;3 ммоль) триэтаноламина. Через 2-3 ч добавляют вновь такое же количество триэтаноламина. Реакционную смесь оставляют на ночь при комнатной температуре, о затем упаривают в вакууме при 40 С.

Оставшееся тяжелое масло тщательно перемешивают с 100 мл дистиллированной воды. Воду сливают и промывку повторяют erqe два раза. Оставшееся масло растворяют.в горячем КОН, по охлаждении продукт осаждается в кристаллической форме. Выход 4,2 г, продукт гомогенный согласно ТСХ в системе Р, Rf = 0,16, к) » = -36 (с.0,50 метайол) .

Ib: Бок-Глю- (Ю -Обзл) -Гли-Apr (NOg)-nHA (мол. вес 715,8).

2,65 r (5,0 ммоль) продукта 1а декарбобензоксилируют и конденсиру957762

IIa: 2НС1 Н-Илей-Глю-Гли-Лрг-пНА (мол.вес 666,6).

100 мг (0,116 ммоль) продукта Ic обрабатывают с фтористьь водородом и чистят в условиях, описанных в примере 1а. — Выход 56 мг (73%), продукт однороден согласно TCX в системе A; pg

0,34, о = -35 (с 0,5, 50%-ная уксусная кислота в дистиллированной воде)Анализ на аминокислоты: 0,96 Илей, 0,94 Глв, 0,96 Apr, 1,00 Гли.

1l р и м е р III: НС1 Бэл-Илей-ГлнГли-Лрг-пНА (мол.вес. 733,2).

IIIa: Кбо-Глн-Гли-Арг (Ы02)-пНА (мол. вес 658,5)..

2,65 r (5 ммоль) соединения 1(бо-Гли-Apr(N02) пНА.декарбобензоксилируют бромистым водородом в уксусной кислоте и копулируют с 2,2 г (5,5 ммоль) Кбо-Глн-ОпНФ по методу, описанному в примере 1а. Неочищенный продукт очищают двойной перекристаллизацией из метанола.

Выход 2,07 r (63%) IIIa. Гомогенность в соответствии с TC?: в системе

A(R(= 0,62), (Cg = -23 (с 0,5 метанол/диметилформамид 9/1). ют с 2,5 r (5,5 ммоль) Бок-Глю(-Обзл

ОпНФ.согласно примеру 1а. Продукт чистят в хроматографической колонке с Сефадексом ЕН в метаноле. Выход

3,25 г (91%). Продукт гомогенный согл2асно TC:(в системе Р; (Ry = 0,22), 5

Q®3 D = -34 (с 1, О метанол) .

I с: Кбо-Илен-Глю (-Обзл) -Гли-Арг (N0 g) -пПА. (Мол. вес 86 2, 9) .

1,08 г (1,5 ммоль) продукта Ib растворяют в 10 мл трифторацетата. 10

Раствор перемешивают 1 ч при комнатной температуре, затем медленно вливают в 75 мл эфира.при сильном перемешивании. Эфирный раствор декантируют и полученййй зернистый остаток erqel5 два раза обрабатывают эфиром по 50 мл;

После сушки в вакууме над Р О и табо

2 летками КОН при 30 С получена трифторуксуснокислая, соль трипептидного проиэведного почти количественно (1, 00 г)20

Продукт гомогенный согласно ТСХ в=системе A.

Продукт растворяют в 20 мл диметилформамида. Раствор охлаждают до . -10 С и нейтрализуют триэтаноламином (0,23 мл), добавляют 0,65 r (1,68 ммоль) Кбо-Илей-ОпНФ и медленно поднимают температуру раствора до комнатной. Через 3 ч раствор вновь охлаждают до -10 С и добавляют 0,12 мл о триэтаноламина. Через 2-3 ч повторно добавляют тризтаноламин и раствор ос тавляют на ночь. Затем избыток 1:бо-Илей-ОпНФ разрушают добавлением

100 мг (1,4 ммоль) н-бутиламина к раствору. Через 30 мин раствор упаривают в вакууме при 40 С. Оставшееся тяжелое масло промывают тремя порциями дистиллированной воды, Масло растворяют в МеОН и чистят хроматографией на Сефадексе ZH-20 в метано- 40 ле. Выход 1,07 r (83%). Продукт гомогенный согласно ТСХ в системе

Р, К = 0,35,tel r> — — -24 (с 0,3 МеОН: диметилформамид 95:5).

Id: Бзл-Илей-Глю (g -Обзл) -Гли- . 45

-Лрг (И02) -йНА.

260 мг (0,30 ммоль) продукта Ic дикарбобенэоксилируют согласно примеру Ia. Продукт показывает два пятна на ТСХ в системе A, (RI = 0,45 и 0,65), и с помощью инфракрасной спектроскопии обнаружено, что продукт является смесью НВг-.Н-Илей-Глю(g -OH).

-Гли-Apr(NO2)- пНА и НВГ ° Н-Илей-Глю (g -Обзл) -Гли-Apr (NO2) — nHA.

Эта смесь и 800 мг (0,35 ммоль) бензойного ангидрида взаимодействуют в условиях, описанных в примере 1а.

Продукт чистят на Сефадексе ZH-20 в метаноле. Получают две фракции:

p — 130 мг, (e)24= -15 (c 0,50,СН СИ) 6О

Rg = 0,20 в Р< и р- 105 MrgerJp

-11 (с 0,5, СН СХ) R f = 0,06 в Р .

С помощью инфпакрасной спектроско.пии обнаружено, что этими двумя фракциями являются Бзл- Илей-Глв(-Обзл)- 65

-Гли-Apr (NO ) -пНА и Бэл-Илей-Глю-Гли-Apr (N02) -nHA.

При взаимодействии с фтористым водородом обе фракции дают одинаковый конечный продукт Те.

Ie:НС1 Бзл-Илей-Глю-Гли-Лрг-пНА (мол. вес 734).

100 мг (0,12 ммоль) К -проууукта

Id 0,5 мл анизола помещают в реакционнув колбу аппарата Сакакибара.

В колбу отгоняют 5 мл сухого фтористого водорода и оставляют реакционную массу на 75 мин при О С. Затем фтористый водород отгоняют под уменьшенным давлением, маслянистый остаток растворяют в 10 мл уксусной кислоты и чистят хроматографией на Сефадексе g-15 в 33%-ной уксусной кислоте (в воде). Затем фракцию, содержащую чистое незащищенное тетрапептидное производное, лиофилизувт. Полученное соединение растворяют в смеси метанол:дистиллированная Вода (95Ф5) и хроматографируют на слабоосновном анионном обменнике Я AE-Сефадекс Л-25 в хлоридной форме, для элюирования используют ту же смесь растворителей.

Метанол удаляют из элвата при 30 С под уменьшенным давлением и оставшийся водный раствор лиофилизируют. Выход 75 мг (85%), продукт однороден согласно ТСХ в системе A (RI = 0,48), осj и = -40 (c 0,5, 50%-ная уксусная кислота в дистиллированной воде)-.

Лналиэ на аминокислоты: 0,98 Илей, 0,95 Глю, 0,98 Apr, 1,00 Гли.

Пример II: 2НС1 Н-Илей-Глю-Гли-Apr-nHA.

957762

lIlb: Трет-Бок-Илей-Глн-Гли-Арг (N0 )-пИА (мол. вес 737,6).

О,бб г (1 ммоль) соединения Illa декарбобензоксилируют бромистцм водородом в АсОН по методу, описанному в примере Ia. Полученное соединение 5 растворяют в 10 мл перегнанного диметилформамида, Раствор охлаждают до -10 С и добавляют триэтиламин о до нейтральной реакции. Выпавший в осадок бромгидрат триэтиламина отфиль-!О тровывают, фильтрат вновь охлаждают до -10 C U к нему добавляют 0,40 r (1,1 мяоль) Бок-Илей-ОпНФ и раствор оставляют медленно нагреваться до комнатной температуры. Через 3 ч раст 5 вор вновь охлаждают до -10 С и буфе- о рируют .0,1 мл, (0,7 ммоль) триэтаноламина. Буферирование повторяют через

2-3 ч. Реакционный раствор оставляют до утра и избыток трет-Бок-Клей-ОпНФ

20 приводят во взаимодействие с 0 1 мл (1 ммоль) н-бутиламина. Через 30 мин раствор упаривают в вакууме при 40 С.

Оставшееся тяжелое масло тщательно .перемешивают с 100 мл дистиллиРован-.. ной воды. Воду декантируют и промывку проводят еще дважды. Оставшееся масло растворяют в метанолв и очищают в колонке с сефадексом ZH-20 в метаноле, используя в качесТве элюирующего средства метанол. Выход

0,56 r (76%). Гомогенность по ТСХ в системе A (Rj = О,бб.).

IIIc ° Бзл-Глн-Гли- Arg(N0> ) -nHA мол. вес 741,6).

0,56 (0,76 ммоль) продукта IIIb 35 растворяют в 5 мл трифторуксусной кислоты. Раствор перемешивают 15 мин при комнатной. температуре, после чего медленно выливают в 100 мл энергично перемешиваемого сухого эфира. Эфир отделяют декантацией и осадок дважды обрабатывают 50 мл эфира. После сушки в вакууме над PgO и таблетками

КОН при 30оC получают трифторуксусную соль тетрапептидного производного почти количественно. Продукт гомогенен в соответствии с тонкослойной хроматограммой в системе A.

Полученное соединение растворяют в 8 мл диметилформамида, охлаждают до -10 С и нейтрализуют тризтаноло амином. Вносят 0,23 г (1 ммоль) бензойного ангидрида и через 30 мин добавляют еще 00 мкл триэтаноламина.

Реакционный раствор оставляют до утра и упаривают в вакууме при 40оC.

Оставшееся тяжелое масло тщательно перемешивают с дистиллированной водой.

Воду декантируют, оставшееся масло растворяют в метаноле и очищают в колонке, содержащей сефадекс ZH-20 в метаноле. Выход 0,55 г (95%). Гомогенность по ТСХ в системе A (R y = 0,64).

IIId. Бэл-Илей-Гли-Глн-Лрг-nHA-HCi (мол. вес 733,3).

0,55 г (0,75 ммоль)III приводят во взаимодействие с фтористоводородной кислотой, очищают (ионообменно) по методу, описанному в примере Ie.

Выход 0,34 г (62%), Гомогенность по

ТСХ в системе A (Ry = 0,41), Pe .) 4

= -40 (с 0,5, 50Ъ-ная уксусная кислот а в дис тиллиров анной воде) .

Остальные промежуточные и конечные продукты, использованные в качестве примеров, синтезированы в соответствии с.методами, описанными в примерах

1-III.

Получение этих соединений и их свойства приведены в таблице. у hl сч сч

М » о о о »!»

Ю о о

° Ф СЧ

М о о

° ф M

M M

Ъ » о о

% Ч °

»A»"Ъ

« М о о

».4 »!с» сч ч

М Ю о о о а

Ю »О с о о

» В M ч!» с с сч с ъ с о о о сс!»О со со

» « о о

С"Ъ ! о

Г

»

»

Р. О. ° Р» /!»»Ъ

ОЪ 1OO»4

OO Ch с в л О 00

v и н н

»» о н н н

О н1 н 1 н

» — » о н н н а v н н н н н н

v и н

1»d н

»»

»6 v н н о о н н н н н н

v v н н н н н о

° » н 0 н н о

»» н

3-Ч о о н н

О н н н н н

О и и

»-» о и и н

V cd н н о н

Ф »6

»-г н c6 6 н»-» н, н н н н . Х

1 ЦР»

»» 16 н а Х

) н н а н н н н

) ) а н 16 х, с6 а н х

О с6

) н се х н

И Ф

Ж Е

1 с6 а н и н . н н н

» а! н н н н с6 а н .н

) »-Ч

»-Ч

»-» С

) н

Б

b0 и !

CD

1 и

Ф с1

PR с.э х

»-» с.3 х

I 1

1 I

1 I

Х 1 I 9 1 I

»6 1 1

Р»1 1 !.» 1 1

О!

Н1 . с

»6 I cd

3 I

О!

Р» I !

Ы I..

»6 I 1 х1»6!

I6 1 g I

1: 1 Н

O! Ol<

О1.Х! х!о! х

О!

Е» 1 1

« — - !

М 1

Ц 1 о х»»

Д)» с!

1 » 1

ХХР»!

ОХФ!

Х Я 1

»6 Х 1

ЦР\ С41 оои

Е» Р» I ехо

Я И I, 1

1 l. о

Р» и о

Ф !»

Ц, ъ . х Р 1

ЦХФ!

О «3 Ж 1 и

Ф ФР»1

I Я Н

I I

1 Р» t

I Е

i И

1 Х

I Р» I

1 Р, I

Г3»

1

1

»6 I

Р О»

Н1О

o t ""»Р Ф

N 1

O I и

»t»! I

Х1 е ,» о ф о

Р 1

06 I,Р„: .< v о ф < х

1 с» о

b0 и

>.

»»

Ю

1 н ф о

Р

1 х

Ф

»» о о ф

< х !

»

»» о

И

b0 и

1 с

1 ф о

Р а

< ! д н» ф

И

1 с, b0 Х и с с 1

1 г-

;» О! о

С2 И !

Р» ОО а

1

Д

Ф с ) н 1

Щ N

< н О о х и

«х с

» х !

1 о"

К м о

С0 И ! °

b0 ! и

< !

> с ) ! х с»! с !

И

Ф

» ( н ф

АХ!6 х

1 и

»

1 с5

И

<.

1 °

Э и ф

957762

«

И

1 г- с с!О О1

О

< И ! » b0

»-»

CD <

1 ,-! ф Ю о ! ч с!

Ю ф о

Э

«-1 Q о о с! ф с6 и и

<

B о з»

С»0 и

3 г!

CD

16

) о .о с»с! !

1 о / х

00 и 1

1, 1-»

Н 1 ъ

»»

»-» 1

» 3 ф о сл !

» н 16

CD ) 1 N, ф с6

) IA

< х х

1 !

О»

»» з о

Ф»

»»0 и с»0 и

1 CC

1 .-! н

1 CD

1 г-! »

»! ф с! о ф о ! н «с» н

1 Ю о о

С!»

v а о ф OQ

< < х х а с

1 1

Ь0 b0

1, и

1 1

Ю Ю ! 1

Р с.э ю

1 1 о о ! и

С! Р х ф и х с6 а х х

< а х

1 о

/,»«

»0 и с»0

° а, й ъ

»-! сд»-!

1 Ю

1 с! и ф M о ф о

1»

» !

»!! Ю

<,ь

»»

О Ю о ф 00

< х х

00 и

< ! з

Ю !

3 н

Ю

«ъ ф

957762

13

Формула изобретения

Составитель В. Волкова

Редактор О. Персиянцева Техред Т.Фанта Корректор С. Шекмар

Заказ 6634/50 Тираж 445 Подпйсное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 11осква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал .ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

1. Способ получения пептидов общей формулы

Rg -А -А -Гли - Арг — ЯИ, где R — водород, бензоил;

R - Н -нитроанилид;

А - аспарагинил, глицил, иэолейцил,.лейцил, валил, пролил, тироэил, фенилаланнл;

А1 — глютаминовая кислота, глютамин, аспарагиновая кислота, или их солей, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что соединение общей формулы Н И-К, в которой Rq имеет указанные значения, подвергают взаимодействию с соответствующей аминокислотой и далее требуемую пептидную структуру постепенно наращивают путем сочетания остальных аминокислот, причем группу Rg используют в

5 качестве защитной группы для С - концевой карбоксильной группы первой аминокислоты.

2. Способ по п.1, о т л и ч а.юшийся тем, что для наращивания требуемой пептидной структуры используют сочетания аминокислот методом активированных эфиров.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Шредер 3., Любке К. Пептиды.

Ч. 1, И., "Иир", 1967, с. 116.